Coronavirus كۆپەيتىش-تىرانسپورتى مۇرەككەپلىكى: NiRAN-RdRp تارماق ئەترىتىنىڭ مۇھىم ۋە تاللانغان NMPylation nsp9 دىكى ساقلانغان تور بېكەتلەرگە

كالىفورنىيە ستانفورد ئۇنۋېرسىتىتى ستانفورد ئۇنۋېرسىتىتى تىببى ئىنىستىتۇتى پېتېر سارنوۋ تەھرىرلىگەن ، 2020-يىلى 12-ئاينىڭ 25-كۈنى تەستىقلانغان (2020-يىلى 25-ئۆكتەبىر تەكشۈرۈلگەن)

بىز كۆپەيتىش ۋە تەدرىجى تەرەققىياتنى قوغداشتا ئىنتايىن مۇھىم بولغان تاجىسىمان ۋىرۇس-ترانسكرىپسىيە مۇرەككەپ ماددىلىرىنى كۆپەيتىشتە تارماق تارماقلارنىڭ ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى دوكلات قىلىمىز.بىز nsp12 بىلەن مۇناسىۋەتلىك NiRAN تور نامىنىڭ يادرودا يادرونىڭ مونوفوسفات (NMP) يۆتكىلىش پائالىيىتى بارلىقىنى ئىسپاتلاپ بەردۇق ھەمدە nsp9 (RNA باغلاش ئاقسىلى) نىڭ نىشانى ئىكەنلىكىنى ئېنىقلىدۇق.NiRAN Mn2 + ئىئونلىرى ۋە ياندىكى ساقلانغان ئاسن قالدۇقلىرىغا تايىنىدىغان رېئاكسىيەدە NMP ھەرىكىتىنىڭ ساقلانغان nsp9 ئامىنو تېرمىنالىغا يانتۇ باغلىنىشىنى قوزغىتىدۇ.NiRAN پائالىيىتى ۋە nsp9 NMPylation نىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسنى كۆپەيتىشتە كەم بولسا بولمايدىغانلىقى بايقالدى.بۇ سانلىق مەلۇماتلار بىزگە ئۇۋىسى ۋىرۇس ئېنزىم بەلگىسىنىڭ بۇ پائالىيىتىنى ئىلگىرىكى پەرەزلەر بىلەن RNA ۋىرۇسىنىڭ سىنىپىدا RNA بىرىكتۈرۈشنىڭ قوزغىتىلىشىنىڭ ئىقتىدار ۋە تەدرىجىي بىردەكلىكى توغرىسىدىكى پەرەزدىكى باغلىنىشىمىزغا يول قويىدۇ.

Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae ۋە باشقا 12 ئائىلە) نىڭ RNA غا تايىنىدىغان RNA پولىمېراسى (RdRps) NiRAN دەپ ئاتىلىدىغان كۆپ خىل ئاقسىلدىن ئاجرىلىپ چىققان قۇرۇلما بولمىغان ئاقسىل (nsp) دىكى ئامىنو تېرمىنال (N تېرمىنال) دائىرىسىگە ئۇلىنىدۇ. 1ab ۋىرۇسلۇق ئاساسلىق ئاقسىل (Mpro) دىن تەركىب تاپقان.ئىلگىرى ، ئارتېرىيە ۋىرۇسى NiRAN-RdRp nsp نىڭ ئۆزىنىڭ GMPylation / UMPylation پائالىيىتى دوكلات قىلىنغان بولۇپ ، يادرونىڭ مونوفوسفات (NMP) نى (ھازىرچە نامەلۇم) ۋىرۇس ۋە ياكى ھۈجەيرە بىئوپولىمېرلاشتۇرۇش ئىشلىرىغا ئۆتكۈنچى ھاسىل قىلىش ئوتتۇرىغا قويۇلغان.بۇ يەردە ، تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ (ئادەم كورونا ۋىرۇسى [HCoV] -229E ۋە ئېغىر دەرىجىدىكى جىددىي خاراكتېرلىك نەپەسلىنىش ئۇنىۋېرسال كېسەللىكى كورونا ۋىرۇسى 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) نىڭ Mn2 + گە تايىنىدىغان NMPylation پائالىيىتىنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىمىز ، بۇ Mpro ۋاسىتىچى nsp9 دىن كېيىن بارلىققا كەلگەن. N تېرمىنالىنىڭ يان تەرىپىدىكى nsps ئاقسىل ئارقىلىق قويۇپ بېرىلىدۇ ، فوسفورامىد nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدىكى دەسلەپكى ئامىن (N3825) بىلەن تۇتىشىدۇ.ئۇرىدىن ترىفوسفات بۇ خىل ئىنكاستىكى ئەڭ ياقتۇرىدىغان يادرو بولۇپ ، ئەمما ئادېنېنولىن ترىفوسفات ، گانوسىن ترىفوسفات ۋە سىتىندىن ترىفوسفاتمۇ ماس كېلىدىغان ئورتاق بالا ئېلېمېنتلاردۇر.قايتا ھاسىل بولىدىغان تاجىسىمان قان تومۇر ۋىرۇسى nsp9 ۋە nsp12 ئاقسىلى ۋە گېن ئارقىلىق ياسالغان HCoV-229E ئۆزگىرىشى ئارقىلىق ئۆزگىرىش تەتقىقاتى NiRAN ۋاسىتىچى nsp9 NMPylation ۋە ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدە ۋىرۇس كۆپەيتىش ئۈچۈن كېرەكلىك قالدۇق ماددىلارنى بەلگىلىدى.سانلىق مەلۇماتلار NiRAN ئاكتىپ تور بېكەت قالدۇقلىرىنىڭ مۆلچەرىنى دەلىللىدى ھەمدە nsp9 N3826 قالدۇقلىرىنىڭ nsp9 NMPylation ۋە ۋىرۇسنىڭ ۋىرۇستا كۆپىيىشىدىكى مۇھىم رولىنى بەلگىلىدى.بۇ قالدۇق ساقلانغان N تېرمىنال NNE تىرىپتىد تەرتىپىنىڭ بىر قىسمى بولۇپ ، تاجىسىمان ۋىرۇس ئائىلىسىدىكى nsp9 ۋە ئۇنىڭ گومولوگىيىسىنىڭ بىردىنبىر ئۆزگەرمەس قالدۇقى ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى.بۇ تەتقىقات باشقا ئۇلانغان ۋىرۇسلارنىڭ NMPylation پائالىيىتىنى ئىقتىدار تەتقىقاتى ئۈچۈن پۇختا ئاساس بىلەن تەمىنلەيدۇ ۋە ۋىرۇسقا قارشى دورىلارنى تەرەققىي قىلدۇرۇشتىكى نىشانلارنى ئوتتۇرىغا قويدى.

Nidovirales مۇسبەت بولغان RNA ۋىرۇسى ھەر خىل ئومۇرتقىلىق ھايۋانلار ۋە ئومۇرتقىسىز ھايۋانلارنى يۇقۇملاندۇرىدۇ (1 ، 2).بۇ بۇيرۇق ھازىر 14 ئائىلىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (3) ، بۇنىڭ ئىچىدە كوروناۋىرۇس ئائىلىسى ئۆتكەن 20 يىلدا كەڭ كۆلەمدە تەتقىق قىلىنغان.ئەينى ۋاقىتتا ، ھايۋانات ساھىبجاماللىرىدىن ئۈچ خىل ھايۋانات تاجىسىمان ۋىرۇسى پەيدا بولۇپ ، ئىنسانلاردا ئېغىر نەپەس يولى يۇقۇملىنىشلىرىنىڭ كەڭ كۆلەمدە تارقىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقارغان.ئېغىر دەرىجىدىكى ئۆتكۈر يۇقۇملۇق كېسەللىكلەر كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان تارقىلىشچان كېسەللىكلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.نەپەس يولى ئۇنىۋېرسال كېسەللىكى كوروناۋىرۇس 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Nidoviruses ئورتاق گېن گۇرۇپپىسىنى ئورتاق ئىشلىتىدۇ ، پەردىگە باغلانغان كۆپەيتىش-كۆچۈرۈش قۇرۇلمىسى (RTC) نىڭ تارماق قىسمى 5-? Terminal تېرمىنالىنىڭ ئۈچتىن ئىككى قىسمى ۋە ۋىرۇس زەررىچىلىرىنىڭ ئاساسلىق قۇرۇلما تارماق قىسمىدا كودلىنىدۇ. .ئاقسىل ، گېننىڭ 3 ?? ² ئاخىرىدىكى ئۈچىنچىسىدە كودلاشتۇرۇلغان (1).بىر ئائىلىلىك پىلانلىق ۋىرۇس (Monoviridae) (8) نى ھېسابقا ئالمىغاندا ، بارلىق ئۇلانغان ۋىرۇسلار RTC تارماق ئەترىتىنى ئىككى چوڭ ئوچۇق ئوقۇش رامكىسى (ORF) ORF1a ۋە ORF1b كودلاشتۇرىدۇ ، بۇلار گېننىڭ RNA دىن تەرجىمە قىلىنغان.ORF1a polyprotein (pp) 1a نى كودلايدۇ ، ORF1a بىلەن ORF1b بىرلىكتە pp1ab نى كودلايدۇ.ORF1a كودلاشتۇرۇلغان ئاساسلىق ئاقسىل (Mpro) نىڭ ئورتاق ئىشتىراك قىلىشى بىلەن ، pp1a ۋە pp1ab ھەر ئىككىسى ئاقسىللىق ھالدا ھەر خىل قۇرۇلما خاراكتېرلىك ئاقسىل (nsps) غا پىششىقلاپ ئىشلىنىدۇ ، بۇ 3CLpro دەپمۇ ئاتىلىدۇ ، چۈنكى ئۇنىڭدا پىكورناۋىرۇسنىڭ 3Cpro بىلەن گومولوگىيەسى بار. 9).بۇ nsps چوڭ ھەرىكەتچان RTC غا توپلانغان دەپ قارىلىدۇ ، گېن RNA (كۆپەيتىش) ۋە بىر يۈرۈش تارماق گېن RNA (ترانسكرىپسىيە) نىڭ بىرىكىشىنى قوزغىتىدۇ ، ORF1b (10) نىڭ تۆۋەن ئېقىمىغا جايلاشقان ORF نىڭ ئىپادىسىنى ماسلاشتۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ؟ ? 12).

يادرولۇق RTC RNA غا تايىنىدىغان RNA پولىمېرازا (RdRp) (13) ، ئادەتتىن تاشقىرى ئائىلىۋى 1 خېلىكازا (HEL1) (14 ، 15) ۋە بىر قانچە RNA بىر تەرەپ قىلىش فېرمېنتىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بۇلار ئاساسلىقى ORF1b ۋە تاجىسىمان ۋىرۇس ئائىلىسىدە كودلىنىدۇ. ئۇنىڭدا nsp12-nsp16 ۋە Arterioviridae جەمەتىدىكى nsp9-nsp12 (پايدىلانما 10â12 گە قاراڭ).RdRp ۋە HEL1 قۇش ئۇۋىسى ۋىرۇسىنىڭ ئىككى (بەشتىن بىرى) ساقلانغان ساھەگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ھەمدە باشقا RNA ۋىرۇسى ئارىسىدا گومولوگىيەگە ئىگە.يادرولۇق كۆپەيتىش باشقا تارماقلارنىڭ ياردىمىدە دەپ قارىلىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە pp1a نىڭ كاربون تېرمىنالى (C تېرمىنالى) رايونىدىن قويۇپ بېرىلگەن بىر قانچە كىچىك nsps ، Mpro نىڭ تۆۋەن ئېقىمى (coronavirus nsp5 ۋە ئارتېرىيە ۋىرۇسى nsp4).ئۇلارنىڭ ئائىلىگە خاس قوغداش ۋە كۆپ خىل پائالىيەتلىرى بار (10 - 12 پايدىلىنىش ماتېرىيالىدا).

نىسپىي ھالدا ، ئۆزگىچە تەرتىپلىك موتىف ئالاھىدىلىكى بار دائىرە بارلىق ئۇۋىدىكى ۋىرۇسلاردا RdRp بىلەن قوشنا بولغان ئامىنو تېرمىنالىدا (N-terminus) تېپىلدى ، ئەمما باشقا RNA ۋىرۇسى يوق (16).ئۇنىڭ ئورنى ۋە يادرونىڭ يۆتكىلىشى (يادرونىڭ مونوفوسفات [NMP] يۆتكىلىش) پائالىيىتىگە ئاساسەن ، بۇ تور نامىنىڭ ئىسمى NiRAN (Nestvirus RdRp بىلەن مۇناسىۋەتلىك يادرونى يۆتكەش).NiRAN-RdRp نىڭ قوش دائىرە بىرىكمىسى كوروناۋىرىدا ئائىلىسىدە nsp12 نى ، ئارتېرىئو ۋىرۇدا ئائىلىسىدە nsp9 نى تەشكىل قىلىدۇ ، باشقا ئۇۋىروۋىدادا ، NiRAN-RdRp ۋىرۇسلۇق پولىروپروتىننىڭ مۇستەقىل nsp سۈپىتىدە تارقىتىلىشىدىن ئۈمىد بار.تاجىسىمان ۋىرۇستا ، NiRAN تور نامىدا ?? 1/450 قالدۇق بار بولۇپ ، ئۇلىنىش رايونى ئارقىلىق C تېرمىنال RdRp تور نامىغا ئۇلىنىدۇ (16? 19).ئات ئارتېرىيە ياللۇغى ۋىرۇسى (EAV) (Arteriviridae) دا ، قايتا ھاسىل بولىدىغان nsp9 Mn2 + ئىئونغا تايىنىدىغان (ئۆزلۈكىدىن) UMPylation ۋە GMPylation پائالىيىتىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ ئۇۋىسى ۋىرۇسى ، AN ، BN ۋە CN دىكى ئۈچ خىل ساقلانغان تەرتىپ بازىسىغا باغلىق.N بولسا NiRAN نى كۆرسىتىدۇ) (16).بۇ نەقىشلەرنىڭ N تېرمىنالى يان تەرىپى بىر قەدەر مۇتەئەسسىپ نەقىش.بۇ قالدۇق ماددىلارنىڭ بەزىلىرى يىراقتىكى ئاقسىل كىناسىدىمۇ ساقلانغان بولۇپ ، ئۇلارنىڭ يادرونىڭ ترىفوسفات (NTP) باغلاش ۋە كاتالىزاتورلۇق پائالىيىتىگە قاتناشقانلىقى ئىسپاتلانغان (20 ، 21).بۇ كۆزىتىشكە ماس ھالدا ، Pseudomonas syringae دىن ياسالغان Peludokinase SelO دىكى بىر قانچە مۇھىم تور بېكەت قالدۇقلىرىنى يېقىندا ئېلان قىلىنغان SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 دەرىجىدىن تاشقىرى چوڭ تىپتىكى ماشىنا بىلەن قۇراشتۇرغىلى بولىدۇ.ساقلانغان Coronavirus NiRAN قالدۇقلىرى ئېلېكترون مىكرو قۇرۇلمىسىدا ئۈستۈنلۈككە ئىگە.قايتا ھاسىل بولىدىغان ئاقسىل (17).پەرەز قىلىنىشىچە ، ھۆججەتلەشتۈرۈلگەن (ئۆزى) U / GMPylation NMP نى (ھازىرقى نامەلۇم) تارماق بالا (16) غا يۆتكەش ئۈچۈن ئۆتكۈنچى ھالەت ھاسىل قىلىدۇ ، NiRAN بىلەن ئاقسىل كىنازا (17 ، 19) نىڭ قۇرۇلما ئوخشاشلىقى بۇ پەرەزمۇ؟ NiRAN باشقا ئاقسىللارنى ئۆزگەرتىدۇ.

ئۇۋىسى ۋىرۇسلار بىلەن ئۆزگىچە ۋە ئۆزگىچە سىستېمىلىق باغلىنىش ۋە RdRp دىن گېن ئايرىلىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان نۇرغۇن ئىقتىدارلار NiRAN نى ئۇۋا ۋىرۇسى ئۈچۈن مۇۋاپىق ئاچقۇچلۇق فېرمېنتقا ئايلاندۇرىدۇ ، بۇ ئۇلارنىڭ پەيدا بولۇشى ۋە كىملىكىدە ئىنتايىن مۇھىم.ئىلگىرى ، NiRAN غا مۇناسىۋەتلىك ئۈچ خىل ئىقتىدارنىڭ گېن گۇرۇپپىسىنى تەرجىمە قىلىش ياكى كۆپەيتىش / تىرانسكرىپسىيەنى تەڭشەش دەپ ئاتالغان.ئەينى ۋاقىتتىكى كەم ۋە تولۇق بولمىغان سانلىق مەلۇماتلارنى ئويلاشقاندا ، ھەر بىر ئىقتىدارنىڭ ئەۋزەللىكى ۋە كەمچىلىكى بار (16).بۇ تەتقىقاتتا ، بىز ئىككى خىل گېنغا ۋەكىللىك قىلىدىغان تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ بىئو-خىمىيىلىك ۋە تەتۈر گېن تەتقىقاتىنى بىرلەشتۈرۈپ ، تەتقىقاتىمىزنى تاجىسىمان ۋىرۇس ئائىلىسىنىڭ تەبىئىي ئۆزگىرىشىنىڭ تەدرىجىي تەرەققىيات ئارقا كۆرۈنۈشىگە قويۇپ ، بۇ سىرلىق ساھە ھەققىدە چۈشەنچىگە ئېرىشىشنى مەقسەت قىلىمىز.بىز RTC دىكى تەبىئىي نىشاننى پەرقلەندۈرۈش ئارقىلىق NiRAN نى چۈشىنىشتىكى زور ئىلگىرلەشلەرنى دوكلات قىلىمىز ، بۇ (ئۈچ خىل پەرەزنىڭ ئىچىدە) بۇ تور نامىنىڭ ئۇۋا ۋىرۇسى RNA نىڭ بىرىكتۈرۈلۈشىنى ئىلگىرى سۈرۈشكە تۆھپە قوشىدۇ.بۇ تەتقىقات يەنە NiRAN نىڭ ۋىرۇس ساھىبجامال كۆرۈنمە يۈزىدىكى باشقا رولى ئۈچۈن مۇمكىنچىلىكلەرنى ئاچىدۇ.

تاجسىمان ۋىرۇس nsp12 گە مۇناسىۋەتلىك NiRAN تور نامىنىڭ فېرمېنتلىق خۇسۇسىيىتىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، بىز E. coli دە ئىنسانلارنىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسى 229E (HCoV-229E) nsp12 نىڭ قايتا ھاسىل قىلىش شەكلىنى ھاسىل قىلىپ ، C تېرمىنالىدا His6 بەلگىسى بار ھەمدە بىرلەشتۈردۇق. ئاقسىل [α32-P] ماتېرىيال ۋە ئۇسۇلدا تەسۋىرلەنگەندەك MnCl2 نىڭ ئالدىدا NTP بىلەن بىللە يوشۇرۇن.رېئاكسىيە مەھسۇلاتىنى ئانالىز قىلغاندا ، رادىئاتسىيەلىك ئاقسىلنىڭ nsp12 (106 kDa) بىلەن بىللە يۆتكىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى ، بۇ تاجىسىمان ۋىرۇس nsp12 نىڭ كوۋېنتېن ئاقسىل- NMP خۇرۇچلىرىنىڭ شەكىللىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغانلىقىنى ، ئەڭ ياخشىسى سۈيدۈك مونوفوسفات (UMP) بىلەن شەكىللەنگەنلىكىنى كۆرسەتتى. B).مىقدار ئانالىزىدا كۆرسىتىلىشىچە ، باشقا يادروغا سېلىشتۇرغاندا ، UMP بىرلەشمىسىنىڭ سىگنال كۈچلۈكلۈكى 2 دىن 3 ھەسسە ئاشقان (1C رەسىم).بۇ سانلىق مەلۇمات تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ NiRAN دائىرىسىنىڭ ئالدىن پەرەز قىلىنغان NMP يۆتكىلىش پائالىيىتى بىلەن بىردەك (16) ، ئەمما تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ NiRAN تور نامىنىڭ يادروغا بولغان مايىللىقى ۋە ئارتېرىيە ۋىرۇسىنىڭ ئوخشىمايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.

ئۆزلۈكىدىن NMPylation پائالىيىتى HCoV-229E nsp12..رېئاكسىيە مەھسۇلاتلىرى SDS-PAGE تەرىپىدىن ئايرىپ ، Coomassie پارقىراق كۆك رەڭ بىلەن بويالغان.(2) رادىئوئاكتىپلىق ئاقسىل فوسفورلۇق تەسۋىر ئارقىلىق تەسۋىرلىنىدۇ.Nsp12-His6 ۋە ئاقسىل مولېكۇلا ماسسىسى (كىلودالتوندا) نىڭ ئورنى A ۋە B دا كۆرسىتىلىدۇ.* P≤0.05.سىگنال كۈچى (پىرسەنت) UTP بىلەن مۇناسىۋەتلىك.

گەرچە NiRAN غا مۇناسىۋەتلىك ئېنزىم پائالىيىتى EAV ۋە SARS-CoV نىڭ ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدە كۆپەيتىلىشىدە ئىنتايىن مۇھىم ئىكەنلىكى ئىسپاتلانغان بولسىمۇ ، ئەمما NiRAN نىڭ كونكرېت ئىقتىدارى ۋە يوشۇرۇن نىشانى تېخى ئېنىقلانمىدى.يېقىندا خەۋەر قىلىنغان NiRAN بىلەن ئاقسىل ئائىلىسىدىكىلەرنىڭ ئاقسىل كىنازاغا ئوخشاش قاتلىنىدىغان ئاقسىل ئائىلىسى ئوتتۇرىسىدىكى قۇرۇلما ئوخشاشلىقى (17 ، 22) بىزنى NiRAN نىڭ باشقا ئاقسىللارنىڭ NMPylation نى قوزغىتىدىغانلىقىنى پەرەز قىلىشقا ئۈندىدى.بىز بىر يۈرۈش يوشۇرۇن گومولوگىيىلىك نىشان ھاسىل قىلدۇق ، بۇلار HCoV-229E ORF1a (nsps 5 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10) كودلاشتۇرۇلغان قۇرۇلما خاراكتېرلىك ئاقسىللارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ھەر بىرىدە C تېرمىنال His6 بەلگىسى بار (SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل) ، ۋە بۇ ئاقسىللارنى nsp12 نىڭ بار ياكى يوقلۇقىدا [α32-P] سۈيدۈك ترىفوسفات ([α32-P] UTP) بىلەن سىڭدۈرۈڭ.E. coli دا ئىشلەپچىقىرىلغان كالا قان زەردابى پىلاستىنكىسى ۋە MBP-LacZα بىرىكتۈرۈش ئاقسىلى كونترول رولىنى ئوينىدى (2A رەسىم ، 1 دىن 7 گىچە).رادىئوئاكتىپلىق ئاقسىل ناترىي دودسىل سۇلفات-پولىئاكرىلامىد گېلى ئېلېكتروفورىسى (SDS-PAGE) ۋە ئاپتوماتىك رادىئاتسىيە ئارقىلىق ئانالىز قىلىنغان بولۇپ ، رېئاكسىيەدە nsp12 ۋە nsp9 بولغان كۈچلۈك رادىئوئاكتىپلىق سىگنالنىڭ بارلىقى بايقالغان.سىگنالنىڭ ئورنى nsp9 نىڭ مولېكۇلا ماسسىسىغا ماس كېلىدۇ ، بۇ nsp9 نىڭ nsp12 ۋاسىتىلىك UMPylation نى كۆرسىتىدۇ (2B رەسىم ، 7-يول).باشقا سىناق ئاقسىللىرىنىڭ UMPylated ئىكەنلىكى بايقالمىدى ، بۇ بىزنى nsp9 نىڭ nsp12 نىڭ ئالاھىدە تارماق قىسمى دەپ يەكۈن چىقىرىشىمىزغا سەۋەب بولدى.1-رەسىمدە كۆرسىتىلگەن ئۆزلۈكىدىن NMPylation سانلىق مەلۇماتلىرىغا ماس ھالدا ، nsp12 تۆت خىل NMP نىڭ ھەممىسىنى nsp9 غا يۆتكىيەلەيدۇ ، گەرچە ئۈنۈمى ئوخشىمىسىمۇ ، UMP> ئادېنېنومىن مونوفوسفات (AMP)> گانوسىن مونوفوسفات (GMP)> سىتىدېن مونوفوسفات (CMP)) ( رەسىم).3 A and B).بۇ سىناقتا ئىشلىتىلگەن شارائىتتا (ئىنكاس ۋە ئاشكارلىنىش ۋاقتىنى قىسقارتىڭ ، nsp12 نىڭ قويۇقلۇقىنى ئازايتىڭ ؛ ماتېرىيال ۋە ئۇسۇللار) ، nsp12 نىڭ ئۆزلۈكىدىن NMPylation نى بايقىيالمىدى (2B رەسىم ، 7-يول ۋە 1B رەسىمنى سېلىشتۇرۇڭ). ئۈنۈملۈك (ۋە كۆپ ئايلانما) UMP nsp12 دىن nsp9 غا يۆتكەلدى.UMP يۆتكەش پائالىيىتى 3C رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك Mn2 + ئىئونلىرىنىڭ بولۇشىنى تەلەپ قىلىدۇ ، ئەمما Mg2 + نىڭ ئالدىدا پەقەت ئەڭ ئاز UMP يۆتكەش پائالىيىتى كۆرۈلگەن ، سىناق قىلىنغان باشقا ئىككى ئوخشىمىغان كاتەكچىنىڭ ئالدىدا ھېچقانداق پائالىيەت يوق.مۇشۇنىڭغا ئوخشاش سانلىق مەلۇماتلار تەركىبىدە سىتىدېن ترىفوسفات (CTP) ، گۋانوزىن ترىفوسفات (GTP) ۋە ئادېنېنولىن ترىفوسفات (ATP) (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S1 رەسىم) بار.

HCoV-229E nsp12- مۇرەسسە قىلىنغان UMPylation nsp9.بىر يۈرۈش ئاقسىل تارماق ئېلېمېنتلىرى (كالا قان زەردابى پىلاستىنكىسى ، MBP-lacZα ۋە ORF1a تەرىپىدىن كودلاشتۇرۇلغان C تېرمىنال His6 دەپ يېزىلغان بىر يۈرۈش HCoV-229E nsps) HCoV-229E nsp12-His6⁺ ۋاسىتىچىسىنىڭ UMPylation پائالىيىتىنى باھالاشقا ئىشلىتىلگەن. ئاقسىل.ماتېرىيال ۋە ئۇسۇلدا تەسۋىرلەنگەندەك nsp12 نىڭ يوقلۇقى (A) ياكى مەۋجۇتلۇقى (B) بولمىغان ئەھۋالدا ئاقسىلنى [α-32P] UTP بىلەن 10 مىنۇت سىڭدۈرۈڭ.A ۋە B نىڭ ئۈستىدە ، Coomassie Brilliant Blue بىلەن بويالغان SDS- پولىئاكرىلامىد گېلى كۆرسىتىلدى ، A ۋە B نىڭ ئاستىدا ، ماس ئاپتوماتىك پروگرامما كۆرسىتىلدى.سول تەرەپتىكى ئاقسىل مولېكۇلا ماسسا بەلگىسىنىڭ ئورنى (كىلودالتوندا) بېرىلگەن.Nsp12-His6 نىڭ ئورنى (B ، ئۈستى) ۋە nsp12-His6 نىڭ nsp9-His6 (B ، 7-يول) نىڭ يوشۇرۇن دەۋرىدە كۆزىتىلگەن رادىئوئاكتىپلىق سىگنالنىڭ ئورنىمۇ كۆرسىتىلدى ، بۇ [α-32P] UMP دىن nsp9-His6 غىچە ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ. (12.9 kDa) ، تەكشۈرۈلگەن باشقا ئاقسىللار ئۈچۈن كۆزىتىلمىگەن.

HCoV-229E NiRAN- ۋاسىتىلىك بىئو-خىمىيىلىك ۋە ۋىرۇس ئالاھىدىلىكى nsp9 NMPylation.(A ۋە B) رېئاكسىيەدە ئىشلىتىلگەن يادرو بىرىكمىسىنىڭ بىرىكمە رولى.Nsp12-His6 ۋە nsp9-His6 ئۆلچەملىك NMPylation تەكشۈرۈشىدە ئوخشىمىغان [α-32P] NTP لار ئالدىدا ئارىلاشتۇرۇلغان ۋە سىڭدۈرۈلگەن.(A ، ئۈستى) Coomassie داغلانغان nsp9-His6 SDS-PAGE تەرىپىدىن ئايرىلغان.(A ، ئاستى) گېلى ئوخشاش رايوننىڭ ئاپتوماتىك سۈرىتى.(2) بەلگىلەنگەن يادرولىق كوفاكتورنىڭ ئالدىدا نىسپىي پائالىيەت (± SEM) ئۈچ مۇستەقىل تەجرىبىدىن بەلگىلىنىدۇ.* P≤0.05.(3) مېتال ئىئوننىڭ رولى.كۆرسىتىلگىنى [α-32P] UTP ۋە ئوخشىمىغان مېتال ئىئونلىرى ئالدىدا ئۆلچەملىك NMPylation سىنىقى ، ھەر بىرىنىڭ قويۇقلۇقى 1MM.C دا ، ئۈستى ، Coomassie داغلانغان nsp9-His6 كۆرسىتىلدى ، C دا ، ئاستى تەرىپىدە ماس ئاپتوماتىك رەسىم كۆرسىتىلدى.بەلگە قويۇلغان ئاقسىلنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى (كىلودالتوندا) A ۋە C نىڭ سول تەرىپىدە كۆرسىتىلىدۇ. ماتېرىيال ۋە ئۇسۇلدا.NMPylation رېئاكسىيەسىدە ئىشلەپچىقىرىلغان رادىئوئاكتىپلىق nsp9-His6 فوسفورلىنىش تەسۋىرى ئارقىلىق بايقالغان (D ، ئۈستى).ياۋا تىپتىكى (wt) ئاقسىلىغا سېلىشتۇرغاندا نىسپىي پائالىيەت D دا كۆرسىتىلىدۇ ، ئاستى ئۈچ مۇستەقىل تەجرىبىدىن ئوتتۇرىچە (± SEM) سۈپىتىدە ئېلىنىدۇ.يۇلتۇزلار ساقلانمىغان قالدۇق ماددىلارنىڭ ئورنىنى ئالىدۇ.(5) يۇقۇملانغاندىن كېيىنكى 24 سائەتتىن كېيىن ئېرىشىلگەن p1 ھۈجەيرىسىنىڭ مەدەنىيەت خاسىيەتلىك ھۈجەيرىسىدىكى ۋىرۇس بەلگىسى تاختاي ئارقىلىق ئېنىقلانغان.ئىنژېنېرلىق HCoV-229E ئۆزگەرتكۈچىنىڭ NiRAN ساھەسىدىكى كود ئالماشتۇرۇش ئورنى كۆرسىتىلدى (قالدۇق نومۇر ئۇلارنىڭ pp1ab دىكى ئورنىغا ئاساسەن).كۆپەيتىش كەمتۈك RdRp ئاكتىپ تور بېكىتى mutant nsp12_DD4823 / 4AA كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن.

NiRAN نىڭ ئاكتىپ تور بېتىنى تېخىمۇ چوڭقۇر چۈشىنىش ۋە nsp9 بەلگىلىك NMP يۆتكەش پائالىيىتىگە مۇناسىۋەتلىك قالدۇق ماددىلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، بىز ئۆزگىرىشچان ئانالىز ئېلىپ باردۇق ، بۇنىڭدا NiRAN AN ، BN ۋە CN موتىفلىرىدىكى مۇتەئەسسىپ قالدۇقلارنى ئالماشتۇردۇق ( 16) ئۇ ئالا (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S2 رەسىم).بۇنىڭدىن باشقا ، مۇتەئەسسىپ Arg-to-Lys ياكى Lys-to-Arg نىڭ ئورنىنىڭ تەسىرى ئىككى خىل ئەھۋالدا باھالاندى.(مەنپىي) كونترول بولۇش سۈپىتى بىلەن ، تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە باشقا ئۇۋا ۋىرۇسلىرىنىڭ NiRAN ساھەسىدە ساقلانمىغان ياكى ئاز ساقلانغان قالدۇقلار ئالا بىلەن ئالماشتۇرۇلىدۇ. K4116A (موتىف ئالدىدىكى) ، K4135A (AN) ، R4178A (BN) ، D4188A BN) ۋە D4280A (CN) nsp9 ئارقىلىق nsp9 NMPylation نى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىتىدۇ ياكى يوقىتىدۇ ، مۇتەئەسسىپ ئالماشتۇرغۇچى ئاقسىل (R4178K) ، K4116R) پائالىيىتى% 60 ۋە% 80 پائالىيەتنى ساقلاپ قالىدۇ ، بۇ ئۆز تەرەپتىكى چەكلىمىلەرنىڭ بوشىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. زەنجىر فىزىكىلىق خىمىيىلىك سەزگۈر (3D رەسىم).باشقا بىر قانچە ساقلانغان قالدۇق E4145A ، D4273A ، F4281A ۋە D4283A نى ئالماشتۇرۇشنىڭ زىيىنى تېخىمۇ ئاز ، nsp9 UMPylation پەقەت ئوتتۇراھال تۆۋەنلەيدۇ.مۇشۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر باشقا NTP لارغا چېتىشلىق nsp9 NMPylation رېئاكسىيەسىدە قولغا كەلتۈرۈلگەن (3D رەسىم ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم) ، بۇ ئالاھىدە ئامىنو كىسلاتانىڭ ئورنىغا قويۇلغان كۆزىتىشنىڭ ئىشلىتىلگەن يادرونىڭ بىرىكمە ماددىسىنىڭ مۇستەقىل ئەمەسلىكىنى ئىسپاتلايدۇ.كېيىنكى قەدەمدە ، بىز بۇ nsp12 ئورۇنباسارلىرىنىڭ ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىكى تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىگە كۆرسىتىدىغان تەسىرىنى سىنىدۇق.بۇنىڭ ئۈچۈن بىز قايتا ھاسىل بولغان ۋاكسىنى ۋىرۇسى (23 ، 24) دە كلونلانغان مۇۋاپىق گېن ئارقىلىق تولۇقلانغان DNA (cDNA) قېلىپىنى ئىشلىتىپ ، 5 -7 ھۈجەيرىسىنى كۆچۈردۇق.بۇ ھۈجەيرىلەردە ئىشلەپچىقىرىلغان يۇقۇملۇق ۋىرۇس ئەۋلادلىرىنىڭ تىترىشى كۆپىنچە HCoV-229E NiRAN ئۆزگىرىشچان ماددىلارنىڭ مۇمكىن ئەمەسلىكىنى كۆرسەتتى (3E رەسىم).ھاياتىي كۈچكە ئىگە بولمىغان بىر گۇرۇپپا ۋىرۇس ئۆزگەرتكۈچى ۋىرۇستا KMP116A ، K4135A ، R4178A ، D4188A ، D4280A ، D4283A) نى يوقىتىش ياكى كۆرۈنەرلىك ئازايتىشتا كۆرسىتىلگەن تاللاشلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئەمما باشقا ئىككى خىل تاللاش بار (K4116R ، E4145A) 80 % reserved?ئۇلارنىڭ in vitro NMPylation پائالىيىتىدە قوشۇمچە چەكلىمىلەرنىڭ بارلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدى.ئوخشاشلا ، NiRAN نىڭ ۋىرۇسلۇق NMPylation پائالىيىتىدە ئوتتۇراھال تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقارغان باشقا ئىككى خىل ئۆزگىرىش (R4178K ، F4281A) تىرىك ۋىرۇس پەيدا قىلدى ، ئەمما ، بۇ ۋىرۇسلار كۆپەيتىش ئارقىلىق تىتاننى كۆرۈنەرلىك ئازايتتى.3D رەسىمدە كۆرسىتىلگەن ۋىرۇس پائالىيىتى سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن بىردەك بولۇپ ، تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە ياكى باشقا ئۇۋا ۋىرۇسى (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8 ، 16) دا ساقلىنالمىغان باشقا تۆت قالدۇقنىڭ ئورنىنى ئالىدۇ. ياۋا تىپتىكى ۋىرۇسقا سېلىشتۇرغاندا ئوتتۇراھال تۆۋەنلىتىلگەن (3E رەسىم).

NiRAN ۋاسىتىچى NMP يۆتكەش پائالىيىتىنىڭ ئاكتىپ RdRp تور نامىغا باغلىق ياكى ئەمەسلىكىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، RdRp نەقىش C دىكى ئوخشىمىغان مېتال ئىئون (11) نى ماسلاشتۇرۇشقا قاتناشقان ئىككى خىل ساقلانغان ئاسپ قالدۇقلىرى ئالانىڭ ئورنىنى ئالدى. نەتىجىدە ئاقسىل nsp12_DD4823 / 4AA ساقلاپ قېلىندى. ئۇنىڭ nsp9 NMPylation پائالىيىتى ، nsp12 نىڭ ۋىرۇسلۇق nsp9 نى ۋاسىتە قىلغان NMPylation پائالىيىتىنىڭ پولىمېرازا پائالىيىتىنى تەلەپ قىلمايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (SI قوشۇمچە ، S4 رەسىم).

Nsp12 ئۈچۈن Nsp9 بەلگىلىك NMP يۆتكەش پائالىيىتىنى قۇرغاندىن كېيىن ، بىز NMP-nsp9 خۇرۇچىنى ئاممىۋى سپېكترومېتىرىيە (MS) ئارقىلىق سۈپەتلەشكە تىرىشتۇق.قايتا ھاسىل بولغان HCoV-229E nsp9 نىڭ تولۇق ئاقسىل ماسسىسى سپېكترى چوققىسىنىڭ چوققىسى 1245 Da (4A رەسىم).Nsp12 نىڭ قوشۇلۇشى nsp9 نىڭ سۈپىتىنى ئۆزگەرتەلمىدى ، بۇ nsp12 ۋە nsp9 نىڭ ئىشلىتىلگەن شارائىتتا مۇقىم مۇرەككەپ شەكىللەنمەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (4A رەسىم).UTP ۋە GTP نىڭ ئالدىدا ، nsp9 ۋە nsp12 بولغان رېئاكسىيەنىڭ كەڭ كۆلەمدە ئۆلچەش نەتىجىسىدە كۆرسىتىلىشىچە ، UTP نىڭ ئاقسىل ماسسىسى 306 Da غا يۆتكەلگەن ، GTP نىڭ ئاقسىل ماسسىسى 345 Da يۆتكىگەن ، بۇ ھەر بىر nsp9 مولېكۇلاسىنىڭ UMP ياكى GMP نى باغلىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. (4-رەسىم) C ۋە D).پەرەز قىلىنىشىچە ، NiRAN ۋاسىتىلىك nsp9 NMPylation غا كېرەكلىك ئېنېرگىيە NTP گىدرولىز ۋە پىروفوسفات قويۇپ بېرىشتىن كېلىدۇ.گەرچە بۇ ئىنكاستا nsp9 (نىشان) دىن 10 ھەسسە ئېشىپ كەتكەن nsp9 (ئېنزىم) دىن ئېشىپ كەتكەن بولسىمۇ ، ئەمما nsp9 نىڭ پۈتۈنلەي دېگۈدەك NMPylation كۆزىتىلگەن ، بۇ nsp12 بىلەن nsp9 نىڭ ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ قىسقا مۇددەتلىك ئىكەنلىكىنى ، nsp12 نىڭ NMPylate نى تېخىمۇ كۆپ NMPylate قىلالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. in vitro مولېكۇلا.

Nsp9 ۋە UTP ياكى GTP نىڭ ئالدىدا nsp9 نىڭ يەككە NMPylation.كۆرسىتىلگىنى HCoV-229E nsp9 (SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، جەدۋەل S1) (AD) نىڭ پارچىلىنىپ كەتكەن تولۇق ئاقسىل ماسسىسى.(A) يالغۇز nsp9 ، (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP نىڭ ئالدىدا ، (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP نىڭ ئالدىدا.

Nsp12 ئارقىلىق UMPylated نىڭ nsp9 قالدۇقلىرىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، nsp9-UMP تىرىپسىن بىلەن يېپىلدى.ھاسىل بولغان پېپتىدلار نانو يۇقىرى ئىقتىدارلىق سۇيۇقلۇق خروموگرافىيە (HPLC) تەرىپىدىن ئايرىپ ، توردا ماسسىمان سپېكترى (MS / MS) تەرىپىدىن ئانالىز قىلىنغان.Byonic يۇمشاق دېتال بولىقى (Protein Metrics) نى ئىشلىتىپ سانلىق مەلۇمات ئانالىزىدا N تېرمىنال ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ UMPylation كۆرسىتىلدى.بۇ قولدا ئىسپاتلاندى.ئالدى پېپتىدنىڭ ماس قەدەملىك سپېكترى [UMP] NNEIMPGK (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S5A رەسىم) 421 m / z بولغان بىر بۆلەكنى ئاشكارىلىدى ، بۇ UMP نىڭ nsp9 نىڭ 1-قالدۇقى بىلەن باغلانغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.

Nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدا ، Asn Orthocoronavirinae ئەزالىرى ئارىسىدا ساقلانغان (SI قوشۇمچە ، S6 رەسىم).گەرچە بىز N تېرمىنالىدىكى دەسلەپكى ئامىنو ئازوتنىڭ UMP نى قوبۇل قىلىش ئېھتىماللىقى ئەڭ يۇقىرى دەپ قارىغان بولساقمۇ ، ئەمما N تېرمىنالىدا NMP باغلاشنىڭ قوشۇمچە ئىسپاتىغا ئېرىشىشنى قارار قىلدۇق.بۇ سەۋەبتىن ، HPLC تەرىپىدىن ساپلاشتۇرۇلغان NMPylated ۋە NMPylated N تېرمىنالى پېپتىد nsp9 ئاتسېتون ۋە ناترىي سىئونوبوروھىدرىد بار.بۇ شارائىتتا پروپىل (25) بىلەن پەقەت ھەقسىز دەسلەپكى ئامىنلارنىلا ئۆزگەرتكىلى بولىدۇ.NNEIMPGK تەرتىپى بىلەن N تېرمىنالى nsp9 دىن ھاسىل قىلىنغان پېپتىد ئىككى ئاساسلىق ئامىننى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، بىرى ئاسننىڭ N تېرمىنالىدا ، يەنە بىرى C تېرمىنالىدىكى Lys نىڭ يان زەنجىرىدە.شۇڭلاشقا ، پروپىل گۇرۇپپىلىرىنى ئىككى ئۇچىدا تونۇشتۇرغىلى بولىدۇ.NMPylated بولمىغان پېپتىدلارنىڭ ئېلىنغان ئىئون خروموگراممىلىرى SI قوشۇمچە ھۆججىتىدە كۆرسىتىلدى ، S5B.ئويلىغىنىدەك ، N تېرمىنال ۋە C تېرمىنال (mono) پروپىللانغان (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S5B رەسىم ، ئۈستۈنكى يول) ۋە دىپروپلىتلانغان پېپتىدلار (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S5B رەسىم ، تۆۋەنكى يول) نى پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ.بۇ ئەندىزە Nsp9 نىڭ NMPylated N تېرمىنالى پېپتىدنىڭ ئىشلىتىلىشى بىلەن ئۆزگىرىدۇ.بۇ خىل ئەھۋالدا پەقەت C تېرمىنال پروپىللانغان پېپتىدنىلا پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ ، ئەمما N تېرمىنال پروپىللانغان پېپتىد ۋە دىپروپىللانغان پېپتىدلار ئېنىقلانمىدى (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S5C رەسىم) ، بۇ UMP نىڭ N تېرمىنال دەسلەپكى ئامىنەگە يۆتكەلگەنلىكىنى كۆرسىتىدۇ. گۇرۇپپا ئۆزگەرتىشتىن.

كېيىنكى قەدەمدە ، (ئالا ياكى سېر بىلەن) ئالماشتۇرىمىز ياكى nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدا ساقلانغان قالدۇقلارنى ئۆچۈرۈپ ، نىشانغا چەك قويۇلغان چەكلىمىلەرنى ئېنىقلايمىز.بىزنىڭ MS سانلىق مەلۇماتلىرىمىزغا ئاساسلانغاندا ، NiRAN nsp9 نىڭ N تېرمىنالى قالدۇقىنىڭ دەسلەپكى ئامىنە بىلەن nsp9-NMP خۇرۇچى ھاسىل قىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ ، nsp9 NMPylation نىڭ ۋىرۇسلۇق ئاساسلىق ئاقسىل (Mpro, nsp5) نى nsp9 N تېرمىنالىدىن قويۇپ بېرىشىنى تەلەپ قىلىدىغانلىقىنى پەرەز قىلدۇق. ئۇنىڭ پولى ئاقسىل ئاقسىلى.بۇ پەرەزنى سىناش ئۈچۈن ، بىز E. coli دا nsp9 بولغان ئالدىنئالا ئاقسىل nsp7-11 ئىشلەپ چىقاردۇق ۋە [α-32P] UTP (ماتېرىيال ۋە ئۇسۇل) نىڭ ئالدىدا ئۆلچەملىك NMPylation سىنىقى ئېلىپ باردۇق.5A رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك (3-يول) ، ئۈزۈلمىگەن nsp7-11 ئالدىن كۆرسەتكۈچ nsp12 بىلەن رادىئوئاكتىپلاشتۇرۇلمايدۇ.بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، ئەگەر nsp7-11 قايتا ھاسىل قىلغۇچى nsp5 ئارقىلىق ئالدىنئالا nsp9 (ۋە باشقا nsps) نى قويۇپ بەرسە ، nsp9 بىلەن يۆتكىلىدىغان رادىئوئاكتىپلىق ئاقسىل بايقالدى ، بۇ بىزنىڭ NiRAN ۋە N- كوۋېنتلىق nsp9-NMP خۇرۇچلىرىنىڭ شەكىللەنگەنلىكى توغرىسىدىكى يەكۈنىمىزنى ئىسپاتلايدۇ. .N تېرمىنالى Asn نىڭ تېرمىنال دەسلەپكى ئامىنە (pp1a / pp1ab دىكى 3825 ئورۇن).بۇ يەكۈننى Nsp9 قۇرۇلمىسى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلغان سىناقلارمۇ قوللايدۇ ، ئۇنىڭدا N- تېرمىنالىدا بىر ياكى ئىككى قوشۇمچە قالدۇق بار.ھەر ئىككى خىل ئەھۋال ئاستىدا ، NiRAN ۋاسىتىچىلىك قىلغان nsp9 نىڭ UMPylation ئەمەلدىن قالدۇرۇلدى (SI قوشۇمچە ، S7 رەسىم).كېيىنكى قەدەمدە ، بىز nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدا 3825-NNEIMPK-3832 پېپتىد تەرتىپىدىن ئۆچۈرۈلگەن بىر ياكى ئىككى ئاسن قالدۇقى بار ئاقسىل ئىشلەپچىقاردۇق.ھەر ئىككى خىل ئەھۋالدا ، nsp9 UMPylation پۈتۈنلەي توسۇلۇپ قالدى (5B رەسىم) ، بۇ ھەقىقىي nsp9 N- تېرمىنۇسنىڭ NMP قوبۇللىغۇچ رولىنى ئوينايدىغانلىقىنى قوشۇمچە ئىسپات بىلەن تەمىنلىدى.

Nsp9 نىڭ ئاقسىلنى پىششىقلاپ ئىشلەش ۋە N تېرمىنال قالدۇقلىرىنىڭ nsp12 ۋاسىتىلىك UMPylation دىكى رولى.(A) nsp9 UMPylation ھەقسىز nsp9 N تېرمىنالىغا ئېھتىياجلىق.Nsp7-11-His6 قايتا ھاسىل بولىدىغان Mpro (nsp5-His6) نىڭ بار ياكى يوقلۇقىدا UTP بولغان NMPylation بايقاش بۇففېردا 30 سېلسىيە گرادۇستا ئالدىن سىلىندى.3 سائەتتىن كېيىن ، ماتېرىيال ۋە ئۇسۇلدا تەسۋىرلەنگەندەك nsp12-His6 نى قوشۇش ئارقىلىق NMPylation تەكشۈرۈشىنى باشلاڭ.كونترول سۈپىتىدە nsp5-His6 (1-يول) ۋە nsp9-His6 (2-يول) بولغان رېئاكسىيە قوللىنىلدى.10 مىنۇتتىن كېيىن ، ئىنكاس ئاخىرلاشتى ۋە ئىنكاس ئارىلاشمىسى SDS-PAGE تەرىپىدىن ئايرىلدى.ئاقسىل Coomassie Brilliant Blue (A ، ئۈستى) بىلەن بويالغان.ئوڭ تەرەپتە Nsp7-11-His6 ئالدىنئالا ۋە nsp5-His6 ۋاسىتىلىك يېرىلىشتىن كېلىپ چىققان پىششىقلاپ ئىشلەنگەن مەھسۇلات كۆرسىتىلدى.دىققەت قىلىڭ (ئۇلارنىڭ كىچىكلىكى سەۋەبىدىن) بۇ گېلىدا nsp7 ۋە nsp11-His6 نى بايقىغىلى بولمايدۇ ، ئىنكاس nsp5-His6 (1 ۋە 4-يوللار ؛ nsp5-His6 نىڭ ئورنى مۇستەھكەم چەمبەر ئارقىلىق كۆرسىتىلىدۇ) بىلەن تولۇقلىنىدۇ. ياكى nsp9-His6 (Lane 2) ئاز مىقداردىكى MBP (ئوچۇق چەمبەر ئارقىلىق كۆرسىتىلىدۇ) قالدۇق بۇلغانما ماددىلارنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، چۈنكى ئۇلار MBP بىرىكتۈرۈش ئاقسىلى سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ (SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل)..B ، SDS-PAGE Coomassie بىلەن بويالغان بولۇپ ، B ، ماس ھالدىكى ئاپتوماتىك رەسىم كۆرسىتىلدى.سول تەرەپتىكى مولېكۇلا ئېغىرلىق بەلگىسىنىڭ ئورنى (كىلودالتوندا) كۆرسىتىلىدۇ..رېئاكسىيە مەھسۇلاتلىرى SDS-PAGE تەرىپىدىن ئايرىپ ، Coomassie Brilliant Blue (C ، ئۈستى) بىلەن بويالغان ، رادىئوئاكتىپلىق nsp9-His6 فوسفورسېنسېن تەسۋىرى ئارقىلىق بايقالغان (C ، ئوتتۇرىدا).ياۋا تىپتىكى (wt) ئاقسىلىنى پايدىلىنىش ئورنى قىلىپ (% 100 قىلىپ تەڭشەلدى) ، نىسپىي NMPylation پائالىيىتى (يەنى ± SEM) ئۈچ مۇستەقىل تەجرىبىدىن ھېسابلىنىدۇ..كۆپەيتىش كەمتۈك RdRp موتىف C قوش ئۆزگىرىشچان DD4823 / 4AA مەنپىي كونترول سۈپىتىدە ئىشلىتىلگەن.

Nsp9 نىڭ N تېرمىنالى (بولۇپمۇ 1 ، 2 ، 3 ۋە 6-ئورۇنلار) Orthocoronavirinae تارماق ئەزالىرىنىڭ ئىچىدە ناھايىتى ساقلانغان (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S6 رەسىم).بۇ قالدۇق ماددىلارنىڭ nsp12 ۋاسىتىلىك nsp9 NMPylation دىكى مۇمكىنچىلىك رولىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدىكى ئۇدا ئىككى ئاسن قالدۇقى ئالا ياكى سېر (يالغۇز ياكى بىرلەشتۈرۈلۈپ) نىڭ ئورنىنى ئالدى.ياۋا تىپتىكى nsp9 بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، N3825 نى ئالا ياكى سېرغا ئالماشتۇرۇش nsp12 ۋاسىتىلىك UMPylation نىڭ ئىككى ھەسسىدىن كۆپرەك تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (5C رەسىم).NMPylation N تېرمىنال قالدۇقىنىڭ يان زەنجىرىنىڭ ئورنىغا N تېرمىنالىدىكى دەسلەپكى ئامىندا پەيدا بولىدۇ دېگەن يەكۈنىمىزگە ماس ھالدا ، N3825A ۋە N3825S نىڭ ئورنىنى ئالغان كۆرۈنەرلىك قالدۇق NMPylation نى كۆردۇق.قىزىقارلىق يېرى ، ئەگەر ئىككىنچى Asn نىڭ ئورنىنى ئالا ياكى سېر ئالماشتۇرسا ، nsp9 UMPylation تېخىمۇ كۈچلۈك تۆۋەنلەيدۇ (10 قېتىمدىن ئارتۇق) ، ئالانىڭ 3 ، 4 ۋە 6-ئورۇنلاردىكى ئورنى پەقەت nsp9 UMPylation غا ئوتتۇراھال تەسىر كۆرسىتىدۇ (2-رەسىم) ).5C).بۇنىڭغا ئوخشاش نەتىجىلەر ATP ، CTP ياكى GTP (SI قوشۇمچە ، S8 رەسىم) ئارقىلىق قولغا كەلتۈرۈلدى.يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار N2826 (nsp9 دىكى 2-ئورۇن) نىڭ nsp9 NMPylation دىكى ئاچقۇچلۇق رولىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.

Nsp9 نىڭ N تېرمىنالى بىلەن NMPylation ئوتتۇرىسىدىكى ئىقتىدار جەھەتتىكى باغلىنىشلىقلىقىغا ئائىت قوشۇمچە ئىسپاتلارغا ئېرىشىش ئۈچۈن ، بىز كوروناۋىرۇس جەمەتىنىڭ nsp9 تەرتىپىنىڭ كۆپ خىل تەرتىپ (MSA) نى ئورۇنلىدۇق (104 دىن 113 قالدۇق ئارىسىدا ئوخشىمايدۇ) (SI قوشۇمچە ، رەسىم) S6).ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، ئورتوكورونا ۋىرۇسىنىڭ 5 خىل گېنىدىكى 47 خىل (بىلىنگەن ۋە قويغۇچى) ئوخشىمىغان سۈت ئەمگۈچىلەر ، قۇشلار ۋە ئۆمىلىگۈچى ھايۋانلارنى يۇقۇملاندۇرىدىغان 5 خىل گېننىڭ ئىچىدە ، جەمئىي 8 قالدۇقنىڭ ئۆزگەرمەيدىغانلىقى بايقالغان.ئۆچۈرۈش ۋە قىستۇرۇشنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئەڭ كەڭ ئۆزگىرىشلەر ئىلگىرىكى قۇرۇلما تەتقىقاتى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن nsp9 نىڭ ئىككىلەمچى قۇرۇلما ئېلېمېنتلىرى ئارىسىدىكى دەۋرىيلىكتە كۆرۈلگەن (26 ?? 28).Nsp9 نىڭ C تېرمىنال قىسمىنىڭ β تال ۋە α helix دا بەش ئۆزگەرمەس قالدۇق بايقالغان.ئۈچ ئۆزگەرمەس قالدۇق nsp9 نىڭ N تېرمىنالىنىڭ NNE موتىفنى تەشكىل قىلىدۇ.مەلۇم بولۇشىچە ، بۇ موتىفنىڭ ئىككىنچى ئاسن بىردىنبىر ئۆزگەرمەس قالدۇق بولۇپ ، ئۇ يەنە يىراقتىكى پاقا تاجىسىمان ۋىرۇسىنىڭ قىياسى nsp9 بىلەن ئورتاقلىشىدىغان بولۇپ ، ئالفالېتو ۋىرۇسىنىڭ كىچىك ئائىلىسىدىكى Letovirinae دىكى Microhyla letovirus 1 تۈرىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ.Nsp9 ئىككىلەمچى قۇرۇلما ئېلېمېنتلىرىدىكى قالدۇق ماددىلارنى قوغداش قۇرۇلما ئويلىنىش ئارقىلىق مۇۋاپىقلاشتۇرۇلۇپ ، قاتلىنىدىغان ياكى مەلۇم بولغان RNA باغلاش خۇسۇسىيىتىنى ساقلاپ قالىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ پىكىر NNE نى قوغداشقا ماس كەلمەيدىغاندەك قىلىدۇ ، بۇ تەتقىقاتتىن ئىلگىرى ، تىرىپتىد تەرتىپىنىڭ ئۆزگىرىشىنى چەكلەيدىغان چەكلىمىلەرنىڭ خاراكتېرى پۈتۈنلەي ئېنىق ئەمەس ئىدى.

Nsp9-NMPylation ۋە NNE قوغداشنىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسنى كۆپەيتىشتىكى مۇھىملىقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، بىز HCoV-229E ئۆزگەرتكۈچىنى ئىشلەپچىقاردۇق ، بۇلار nsp9 N تېرمىنال قالدۇقىنىڭ يەككە ياكى قوش ئورنىنى ئالىدۇ ، بۇ nsp9 NMPylation نىڭ ۋىرۇستا زىيانلىق ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.باشلاشتىن بۇرۇن ، بىز بۇ ئورۇنلارنىڭ (nsp8 | 9 تازىلاش مەيدانىغا يېقىن) C تېرمىنالى pp1a رايونىنىڭ ئاقسىلنى بىر تەرەپ قىلىشىغا تەسىر كۆرسىتەمدۇ يوق دېگەن سوئالغا جاۋاب بېرىشكە تىرىشىمىز.Nsp9 نىڭ N تېرمىنالىدا مۇناسىپ ئورۇننى ئۆز ئىچىگە ئالغان بىر يۈرۈش nsp7-11 پولىروپروتىن قۇرۇلمىسى E. coli دا ئىشلەپچىقىرىلىپ ، قايتا ھاسىل بولغان Mpro بىلەن كېسىلگەن.تۆت ئورۇننىڭ پروتېئولىتلىق يېرىلىشى (nsp9 يان تەرەپتىكى تور بېكەتنىمۇ ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ھېچقانداق كىرگۈزۈلگەن ئالماشتۇرۇشنىڭ تەسىرىگە كۆرۈنەرلىك ئۇچرىمايدۇ (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S9 رەسىم) ، بۇ ئاقسىللارنىڭ قۇرۇلما ئۆزگىرىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالمايدۇ ، Mpro ۋاسىتىچى nsp8 | 9 ئايرىش (ياكى باشقا) توربېكەت.

Huh-7 ھۈجەيرىسى گېن ئۇزۇنلۇقى HCoV-229E RNA بىلەن ئالماشتۇرۇلدى ، nsp9 N تېرمىنالىدا ساقلانغان NNE تىرىپتىدسىد (N3825 ، N3826 ۋە E3827) دىكى ئالا ياكى سېرنىڭ ئورنىنى كودلاشتۇردى ، بۇ ئۆزگىرىشلەرنىڭ كۆپىنچىسى ئەجەللىك ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى.بىز N تېرمىنالى Asn (N2835A ياكى N2835S) نىڭ Ser ياكى Ala نى ئالماشتۇرۇش ئارقىلىق ۋىرۇسنى قۇتۇلدۇرالىدۇق ، ئەمما NNE تەرتىپىدە (N3826A ، N3826S ، NN3825 / 6AA ، باشقا يەككە ۋە قوش ئۆزگىرىشلەر بىلەن ۋىرۇسنى ئەسلىگە كەلتۈرەلمىدۇق). NN3825 / 6SS), E3827A) (5D رەسىم).

بۇ نەتىجىلەر شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ توقۇلما مەدەنىيىتىدە كۆپىيىشى چەكلەنگەن (ئوخشاش ياكى ئوخشىشىپ كېتىدىغان) ، بەدەندىكى nsp9 NMPylation تور بېكەتلىرىنىڭ تەبىئىي ئۆزگىرىشىنى چەكلەپ ، بۇ ئىنكاسنىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ ھاياتلىق دەۋرىدىكى ئاچقۇچلۇق رولىنى قوللايدۇ.

ئەڭ ئاخىرقى بىر يۈرۈش سىناقلاردا ، بىز C تېرمىنالى His6 دەپ يېزىلغان SARS-CoV-2 nsp12 ۋە nsp9 ، E. coli دىكى ئىككى خىل ئۆزگىرىشچان nsp12 نى ئىشلەپچىقاردۇق.NiRAN ۋە RdRp ساھەلىرىدىكى ئاكتىپ تور بېكەت قالدۇقلىرى ئايرىم-ئايرىم ھالدا Ala نى ئىشلىتىڭ (6A ۋە SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S2 جەدۋەل).SARS-CoV-2 nsp12 دىكى K4465 HCoV-229E دىكى K4135 غا ماس كېلىدۇ (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S2 رەسىم) ، بۇ NiRAN پائالىيىتى ۋە HCoV-229E كۆپەيتىشتە تەلەپ قىلىنغانلىقى ئىسپاتلاندى (3D ۋە E رەسىم).بۇ قالدۇق ئارتېرىيە ۋىرۇسى EAV nsp9 K94 قالدۇقىغىمۇ ماس كېلىدۇ ، بۇ ئىلگىرى NiRAN ئۆزلۈكىدىن UMPylation / ئۆزى GMPylation (16) ئۈچۈن زۆرۈر ئىكەنلىكى كۆرسىتىلدى.6B رەسىمدە كۆرسىتىلگەندەك ، SARS-CoV-2 nsp12 نىڭ nMP9 نى تارماق بالا قىلىپ UMP يۆتكەش پائالىيىتى بار ، nsp12_K4465A ئاكتىپ تور بېكەتنىڭ ئاكتىپچانلىقى ئاكتىپ ئەمەس.RdRp موتىف C نىڭ SDD ئالاھىدىلىك تەرتىپىدىكى قوش ئالماشتۇرۇش UMP يۆتكىلىش پائالىيىتىگە تەسىر كۆرسەتمەيدۇ (6B رەسىم) ، بۇ RdRp پائالىيىتىنىڭ nsp9 UMPylation غا بىۋاسىتە تەسىر كۆرسەتمەيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.مۇشۇنىڭغا ئوخشاش سانلىق مەلۇماتلار CTP ، GTP ۋە ATP (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S10 رەسىم) ئارقىلىق ئېلىنغان.خۇلاسىلەپ ئېيتقاندا ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار NiRAN ۋاستىچى nsp9 NMPylation نىڭ تاجىسىمان ۋىرۇستا سۆڭەك ئۆسمىسىنىڭ ئوخشىمىغان گېنلىرىغا ۋەكىللىك قىلىدىغان تاجىسىمان ۋىرۇستا مۇتەئەسسىپ پائالىيەتنىڭ بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.

SARS-CoV-2 nsp12 ۋاسىتىلىك NMPylation نىڭ nsp9.(A) Coomassie دا داغلانغان SDS- پولىئاكرىلامىد گېلى NMPylation سىنىقىدا ئىشلىتىلگەن قايتا ھاسىل بولىدىغان ئاقسىلنى كۆرسىتىپ بەردى.كونترول سۈپىتىدە ، SARS-CoV-2 nsp12 نىڭ NiRAN دائىرىسى (K4465A) ۋە RdRp تور نامىدا (DD5152 / 3AA) ئاكتىپ تور بېكەت ئالماشتۇرۇلغان ئۆزگىرىشچان ئاقسىل ئىشلىتىلگەن.قالدۇق نومۇر pp1ab دىكى ئورۇنغا ئاساسەن يېزىلغان.()سول تەرەپتىكى بەلگە قويۇلغان ئاقسىلنىڭ مولېكۇلا ماسسىسى (كىلودالتوندا) كۆرسىتىلىدۇ.

NiRAN تور دائىرىسى ئادەتتە Nidovirales (16) دا ساقلىنىدۇ ، بۇ ئۇلارنىڭ Nidovirus نىڭ كۆپىيىشىدە كەم بولسا بولمايدىغان فېرمېنتلىق رېئاكسىيەنى قوزغىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ.بۇ تەتقىقاتتا ، تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ NiRAN دائىرىسىنىڭ NMP (NTP دىن ھاسىل قىلىنغان) نى ۋىرۇس كۆپەيتىشكە قاتناشقان سىرلىق RNA باغلاش ئاقسىلى (26 ?? 29) غا nsp9 غا يۆتكىگەنلىكىنى ئىسپاتلىيالىدۇق. coronavirus RTC نىڭ ھەمراھى.

NiRAN تور دائىرىسى ئۈچ تەرتىپلىك نەقىش (AN, BN ۋە CN) دىن ئورتاق بەھرىمان بولىدۇ ، بۇنىڭ ئىچىدە ئىنتايىن ئاز ساندىكى قالدۇق ماددىلار بار ، ئۇلار بارلىق ئائىلىلەردە مونوپوللۇق ، ئەمما ئالاھىدە پەرقلىنىدىغان Nidovirales تەرتىپىدە ساقلىنىدۇ (8 ، 16).يېقىنقى تەتقىقاتلار شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ئۇلار قۇرۇلما خاراكتېرلىك ئاقسىل كىنازاغا ئوخشاش ئاقسىللار بىلەن ئاساسەن مۇناسىۋىتى يوق بولۇپ ، ئۇلار ئەسلىدە SelO ئائىلىسى دەپ ئاتالغان (17 ، 19 ، 22 ، 30 ، 31).SelO غا مۇناسىۋەتلىك ئاقسىللارنىڭ كىنازا قاتلىمى بار ، ئەمما كلاسسىك كىنازلاردا ساقلانغان بىر قانچە ئاكتىپ تور بېكەت قالدۇقلىرى كەمچىل (22 ، 32).ئاكتىپ تور بېكەتكە باغلانغان ۋە كونكرېت ئۆز-ئارا تەسىر ئارقىلىق مۇقىملاشقان ATP مولېكۇلاسىنىڭ تەتۈر يۆنىلىشىگە ئاساسەن ، SelO قىياس قىلىندى ۋە كېيىن AMP (فوسفاتنىڭ ئورنىدا) ئاقسىلنىڭ ئاستى قىسمىغا (22) يۆتكىلىدىغانلىقى جەزملەشتۈرۈلدى ، SelO غا ئوخشاش يەنە بىر باكتېرىيە YdiU بار. يېقىندا UMP نىڭ Tyr ۋە ئۇنىڭ ئوخشىمىغان ئاقسىل تارماق ئېلېمېنتلىرىنىڭ قالدۇق ماددىسىنىڭ قويۇق باغلىنىشىنى جانلاندۇرىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى (33).

تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN تور نامىنىڭ ئاكتىپ ئاكتىپ تور قالدۇقلىرىنىڭ مۆلچەرىنى دەلىللەش ۋە كېڭەيتىش ئۈچۈن ، بىز بىيو خىمىيىلىك ۋە تەتۈر گېنولوگىيە ئۇسۇلىنى ئىشلىتىپ ، تاجىسىمان ۋىرۇس nsp12 (3D ۋە E ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم ۋە جەدۋەل) S1â S4).سانلىق مەلۇماتتا كۆرسىتىلىشىچە ، HCoV-229E K4135 ، R4178 ۋە D4280 نىڭ ئالا بىلەن ئالماشتۇرۇلۇشى ۋىرۇس NMP يۆتكەش پائالىيىتى ۋە ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىكى ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىنى يوقىتىدۇ (3D ۋە E ۋە SI قوشۇمچە دېتاللىرى ، S3 رەسىم) ، ئۇلارنىڭ NTP γ فوسفاتتىكى مەۋجۇتلۇقىنى قوللايدۇ. (K4135, R4178) ۋە ئاكتىپ تور بېكەت مېتال ئىئونلىرىنىڭ ماسلىشىشى (D4280).E4145A نىڭ قوغدىلىدىغان Glu نىڭ قۇش ئۇۋىسى ۋىرۇسى دائىرىسىدە K4135 (17) ئورنىنى مۇقىملاشتۇرىدىغانلىقى مۆلچەرلەنگەن ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىنى يوقىتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى ، ئەمما ھەيران قالارلىقى ، بۇ پائالىيەت ۋىرۇس NMPylation تەكشۈرۈشىدە ساقلاپ قېلىندى (3D ۋە E ۋە رەسىملەر SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم ۋە جەدۋەل S1 - S4).مۇشۇنىڭغا ئوخشاش كۆزىتىش سالمونېللا تايفۇرىيۇمنىڭ YdiU گومولوگىيىسى (E130A) (33) دە مۇناسىپ ئالماشتۇرۇش ئېلىپ بېرىلغاندا ئوتتۇرىغا قويۇلغان.يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار كاتالىزاتورلۇق فۇنكسىيەنى ئەمەس ، بەلكى بۇ ساقلانغان قالدۇقنىڭ تەڭشەش ئىقتىدارىنى قوللايدۇ.

ساقلانغان Phe قالدۇقى (F4281A) نى HCoV-229E NiRAN دائىرىسىدىكى ئۇۋا ۋىرۇسى دائىرىسىگە ئالماشتۇرۇش (8) ۋىرۇستا NMPylation پائالىيىتىنىڭ تۆۋەنلىشىنى ۋە ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدە ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىنىڭ كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (3D ، E ۋە SI رەسىم) قوشۇمچە ، S3 رەسىم).سانلىق مەلۇماتلار بۇ قالدۇقنىڭ مۇھىم تەڭشەش ئىقتىدارى بىلەن بىردەك ، مەسىلەن ئىلگىرى كۆرسىتىلگەن گومولوگىيىلىك DFG نەقىش Phe قالدۇقى.كلاسسىك ئاقسىل كىناسىدا ، ئۇ Mg2 + باغلاش ھالقىسىنىڭ بىر قىسمى بولۇپ ، ئومۇرتقا قۇراشتۇرۇش ۋە تەڭشەشكە ياردەم بېرىدۇ؟؟؟ئۈنۈملۈك كاتالىزاتورلۇق پائالىيەت ئۈچۈن تەلەپ قىلىنىدۇ (32 ، 34).Ala ۋە Arg نىڭ ئورنىنى K4116 قالدۇقى (preAN نەقىشتە) ئايرىم-ئايرىم ھالدا ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىنى يوقىتىپ ، مۆلچەردىكىگە ئوخشاش ، ئامىنو كىسلاتا تەرەپ زەنجىرىنىڭ ئوخشىماسلىقىغا ئاساسەن ، ۋىرۇسنىڭ NMP يۆتكىلىش پائالىيىتىگە ئوخشىمىغان تەسىرلەرنى كۆرسەتتى (3D ۋە E ۋە SI رەسىملىرى) , S3 رەسىم).ئىقتىدارلىق سانلىق مەلۇمات قۇرۇلما ئۇچۇرلىرى بىلەن بىردەك بولۇپ ، بۇ قالدۇقنىڭ ATP فوسفات بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر ئورناتقانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (17).باشقا ئۇۋىسى ۋىرۇس ئائىلىلىرىنىڭ NiRAN ساھەسىدە ، HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 نىڭ ئورنىنى Lys ، Arg ياكى His (8) ئىگىلىدى ، بۇ بۇ قالدۇق ماددىلارنىڭ ئىقتىدار چەكلىمىسىنىڭ بوشىتىلغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.D4188A ۋە D4283A نىڭ ئورنىنى ئېلىش فېرمېنت پائالىيىتىنى يوقىتىدۇ ياكى كۈچلۈك ئازايتىدۇ ۋە ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىنى يوقىتىدۇ (3-رەسىم).بۇ ئىككى قالدۇق كۆپىنچە (ئەمما ھەممىسىدە) ئۇۋا ۋىرۇسىدا ساقلىنىدۇ (8) ، بۇ مۇھىم ئائىلىگە خاس ، ئەمما كاتالىزاتورلۇق بولمىغان ئىقتىدارنى كۆرسىتىدۇ.Coronaviridae ياكى باشقا Nestioviridae ئائىلىلىرىدە ساقلانمىغان باشقا بىر قانچە Lys ۋە Asp قالدۇقلىرى (K4113A, D4180A, D4197A ۋە D4273A) نىڭ ئالا ئورنى كونترول قىلىندى.ئويلىغىنىدەك ، بۇ ئورۇنباسارلار ئاساسەن بەرداشلىق بېرەلەيدۇ ، بەزى ئەھۋاللاردا فېرمېنت پائالىيىتى ۋە ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشى سەل تۆۋەنلەيدۇ (3-رەسىم ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم).ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ ئۆزگىرىشچان سانلىق مەلۇماتلىرى EAV NiRAN-RdRp (16) نىڭ ئۆزلۈكىدىن GMP ۋە تەتۈر گېن سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن ئىنتايىن ماس كېلىدۇ ، بۇنىڭدا EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ورتولوگىيە) قالدۇق K94 (HCoV- 229E K4135) مۇھىم ئىقتىدارلارغا ماس كېلىدۇ) ، R124 (R4178 غا ماس كېلىدۇ) ، D132 (D4188 غا ماس كېلىدۇ) ، D165 (D4280 غا ماس كېلىدۇ) ، F166 (F4281 غا ماس كېلىدۇ).بۇنىڭدىن باشقا ، HCoV-229E مۇتاگېنېز سانلىق مەلۇماتلىرى ئىلگىرى خەۋەر قىلىنغان SARS-CoV تەتۈر گېن سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن بىردەك ۋە كېڭەيتىلگەن (16) ، بۇ ماس ھالدىكى CN موتىف Phe-to-Ala ئۆزگىرىشچان SARS-CoV_nsp12 The غا ئوخشاش. phenotype تەسۋىرلەنگەن -F219A ۋە HCoV-229E_F4281A (3 D ۋە E ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم ۋە S1-S4).

UTP ۋە GTP (ئۆزلۈكىدىن NMPylation ئىنكاسىدا) ئېنىق مايىل بولغان EAV ورتولوگلىرى (16) بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، تەتقىقاتىمىزدا تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN تور نامىنىڭ (HCoV-229E ۋە SARS-CoV-2 ۋەكىللىك قىلىدىغان) ئۈنۈملۈك بولالايدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. UMP غا ئازراق مايىللىق بولسىمۇ ، تۆت NMP نىڭ ھەممىسىنى يۆتكىدى (1 ۋە 3-رەسىم).كونكرېت NTP ئورتاق گەۋدىسىنىڭ بىر قەدەر تۆۋەن ئالاھىدىلىكى يېقىندا خەۋەر قىلىنغان SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 دەرىجىدىن تاشقىرى بىرىكمە قۇرۇلما بىلەن بىردەك بولۇپ ، ADP-Mg2 + NiRAN نىڭ ئاكتىپ تور بېكىتىگە تۇتىشىدۇ ، ئەمما ئادېنېن قىسمى بىلەن ئەمەس. كونكرېت ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ شەكىللىنىشى (17).تەتقىقاتىمىزدا ، NMPylation رېئاكسىيەسىدە ئىشلىتىلگەن يادرونىڭ تۈرى ئۆزگىرىشچان ئاقسىلنىڭ پائالىيىتىگە ھېچقانداق پەرقلىق تەسىر كۆرسەتمەيدۇ (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 رەسىم) ، بۇ قالدۇق ماددىلارنىڭ ھېچقايسىسىنىڭ مەلۇم يادرونىڭ باغلىنىشى بىلەن زىچ مۇناسىۋەتلىك ئەمەسلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە ئارتېرىيە ۋىرۇسىنىڭ NiRAN ساھەسىدە كۆزىتىلگەن ئوخشىمىغان NTP ئورتاق بالا چۈشۈرۈش ئەۋزەللىكىنىڭ قۇرۇلما ئاساسى ۋە يوشۇرۇن بىئولوگىيىلىك ئەھمىيىتى يەنىلا تەتقىق قىلىنىۋاتىدۇ.ئۇلار راست بولۇشى مۇمكىن ياكى ئۇلارنىڭ تەتقىقاتىنىڭ چەكلىمىسىدىن بولۇشى مۇمكىن.ھازىر ، ئارتېرىيە ۋىرۇسى NiRAN تور نامىنىڭ يوشۇرۇن NMPylator پائالىيىتىنىڭ (ئىلگىرى ئالاھىدىلىككە ئىگە ئۆزلۈكىدىن NMPylation پائالىيىتىگە سېلىشتۇرغاندا) ئارتېرىيە بىلەن تاجىسىمان قان تومۇرنىڭ ئوخشاشلىقىنى كۆزدە تۇتۇپ ، ئوخشىمىغان ئورتاق بالا چۈشۈرۈش ئەۋزەللىكىگە ئىگە ئىكەنلىكىنى نەزەردىن ساقىت قىلىشقا بولمايدۇ. NiRAN تور دائىرىسى ئۇنىڭ چېكىدە.تەرتىپ بويىچە سېلىشتۇرۇش (16).Mg2 + نى كوفاكتور قىلىپ ئىشلىتىدىغان ساختا سېلېنوغا سېلىشتۇرغاندا ، تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە ئارتېرىيە ۋىرۇسى NiRAN نىڭ پائالىيىتى Mn2 + (16) گە باغلىق (3C رەسىم ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S1 رەسىم).UTP غا Mn2 + تايىنىشچانلىقى ۋە روشەن مايىللىقى ئاقسىل NMPylators نىڭ ئادەتتىن تاشقىرى ئالاھىدىلىكى بولۇپ ، سالمونېللا تايفۇرىيۇمنىڭ YdiU ئاقسىلىدا تېخى جەزملەشتۈرۈلۈپ ، Mn2 + غا تايىنىدىغان ئاقسىل ساپېرون UMPylation نىڭ ھۈجەيرىلەرنى بېسىم كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان ھۈجەيرە ATP كۆلچىكىدىن قوغدايدۇ. 33).

يېقىندا تەسۋىرلەنگەن تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN دائىرىسى بىلەن ھۈجەيرە ئاقسىل كىناسى (17،19) نىڭ قۇرۇلما ئوخشاشلىقى NiRAN نىڭ NMP نى بۇ تەتقىقاتتا دوكلات قىلغان باشقا ئاقسىللار بىلەن ئۆز-ئارا باغلاش ئىقتىدارىنى قوشۇمچە قوللايدۇ.بىز مۇمكىن بولغان NiRAN نىشانلىرىنى HCoV-229E ORF1a كودلاشتۇرۇلغان ئاقسىلغا مەركەزلەشتۈردۇق ، بۇلار RTC نىڭ ORF1b كودلاشتۇرۇلغان كۆپەيتىلگەن نۇسخىسىغا بىۋاسىتە ياكى ۋاسىتىلىك ياردەم قىلىدىغانلىقى مەلۇم (12 ، 35).بىزنىڭ سىناقلىرىمىز nsp9 نىڭ ئۈنۈملۈك ۋە كونكرېت NMPylation نى تولۇق ئىسپات بىلەن تەمىنلەيدۇ (2-رەسىم).ئەگەر نىشان ئاقسىلى ئېنزىم (nsp12) نىڭكىدىن 8 ~ 10 ھەسسە يۇقىرى بولغان قۇتۇپتىن ئېشىپ كەتسە ، nsp9 نىڭ پۈتۈنلەي (mono) NMPized ئىكەنلىكى جەزملەشتۈرۈلگەن (4-رەسىم).بىز nsp12 بىلەن nsp9 ئوتتۇرىسىدىكى ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ قىسقا مۇددەتلىك ئىكەنلىكى ۋە nsp9 (باشقا RTC تارماق ئاپپاراتلىرى بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا) مۇقىم مۇرەككەپ شەكىللەنمەيدىغانلىقىنى يەكۈنلىدۇق.بۇ يەكۈننى SARS-CoV ئاقسىلى (35) دىكى ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر تەتقىقاتى قوللايدۇ.MS تەھلىلى nsp9 نىڭ N تېرمىنال قالدۇقىنىڭ دەسلەپكى ئامىنەسىنى NMPylation تور بېكىتى قىلىپ بېكىتتى (SI قوشۇمچە ، S5 رەسىم).فوسفورامىد باغلىنىشى ۋە N تېرمىنال ئامىنو گۇرۇپپىسىنىڭ شەكىللىنىشى NiRAN ۋاسىتىچى NMPylation پائالىيىتىنى Pseudomonas syringae SelO ۋاسىتىچى AMPylation رېئاكسىيەسىدىن پەرقلەندۈرىدۇ ، بۇ Ser ، Thr ياكى Tyr قالدۇقلىرى پېپتىد خۇرۇچىدا O ئۇلانغان AMP نىڭ شەكىللىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ. 22) ، ۋە S. typhimurium YdiU O ئۇلانغان (Tyr بىلەن) ۋە N ئۇلانغان (ئۇنىڭ بىلەن) پېپتىد- UMP خۇرۇچلىرىنى شەكىللەندۈرىدۇ.SelO ئاقسىل ئائىلىسىدىكى چەكلىك ئۇچۇرلار بۇ چوڭ ئاقسىل ئائىلىسىدىكىلەرنىڭ پېپتىد- NMP خۇرۇچلىرىنىڭ شەكىللىنىشىدە زور پەرقلىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇ تېخىمۇ چوڭقۇرلاپ تەتقىق قىلىشقا ئەرزىيدىغان قىزىقارلىق كۆزىتىش.

بۇ تەتقىقاتتا ئېرىشكەن سانلىق مەلۇماتلار بىزنى nsp9 نىڭ NMPylation ھەقسىز N تېرمىنالىغا ئېھتىياجلىق دەپ پەرەز قىلىشقا يېتەكلىدى.ۋىرۇس كۆپەيتىش ئارقا كۆرۈنۈشىدە ، بۇنى Mpro ۋە pp1ab مۇرەسسە قىلغان كۆپەيتىلگەن پولىروپروتىن pp1a دىكى nsp8 | nsp9 پىششىقلاپ ئىشلەش ئورنىنىڭ ئاقسىل ئېرىتمىسى بىلەن تەمىنلەيدۇ.كۆپىنچە تاجىسىمان ۋىرۇسلاردا ، بۇ ئالاھىدە تور بېكەتنىڭ (VKLQ | HCoV-229E دىكى NNEI) بىلەن باشقا تاجىسىمان ۋىرۇس Mpro تازىلاش ئورۇنلىرىنىڭ پەرقى Asn (ئالا ، سېر ياكى گلى قاتارلىق باشقا كىچىك قالدۇقلار ئەمەس) P1â نى ئىگىلەيدۇ؟؟؟ئورنى (36).دەسلەپكى تەتقىقاتتا ئېرىشكەن پېپتىد تازىلاش سانلىق مەلۇماتلىرىدا كۆرسىتىلىشىچە ، nsp8 | nsp9 تور بېتىنىڭ تازىلاش ئۈنۈمى باشقا تور بېكەتلەرنىڭكىدىن تۆۋەن بولۇپ ، بۇ 1) بۇ تور بېكەتنىڭ C تېرمىنالىنى ۋاقتىدا بىر تەرەپ قىلىشتا تەڭشەش رولى بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. pp1a رايونى ياكى 2) a ئالاھىدە ساقلانغان nsp9 N- تېرمىنۇسنىڭ ۋىرۇس كۆپەيتىشتىكى رولى (37).سانلىق مەلۇماتلىرىمىز (5A رەسىم) شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، ھەقىقىي N تېرمىنال تەرتىپىنى ئېلىپ يۈرگەن nsp9 نىڭ قايتا ھاسىل قىلىش شەكلى nsp12 تەرىپىدىن ئۈنۈملۈك NMPized قىلىنغان.N تېرمىنال يان تەرەپ تەرتىپى Xa ئامىلى (nsp9-His6; SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل) ياكى Mpro ۋاسىتىلىك ئايرىش (nsp7-11-His6 ؛ 5A رەسىم ۋە SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل) تەرىپىدىن چىقىرىۋېتىلدى.موھىم يېرى شۇكى ، ئۈزۈلمىگەن nsp9 بولغان ئالدىنئالا nsp7-11-His6 nsp12 نىڭ NMPylation غا قارشىلىق كۈچىنى كۆرسەتتى ، بۇ بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىزغا ماس كېلىدۇ ، بۇ nsp9-NMP خۇرۇچىنىڭ N تېرمىنال دەسلەپكى ئامىنە ئارقىلىق شەكىللەنگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (SI قوشۇمچە ، S5 رەسىم) .NiRAN تارماق ئېلېمېنتنىڭ ئالاھىدىلىكىنى تېخىمۇ چوڭقۇر چۈشىنىش ئۈچۈن ، ئاندىن بىز nsp9 نىڭ ياندىكى N تېرمىنال قالدۇقلىرىغا دىققەت قىلدۇق.باشقا ئاقسىللار بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا ، ئۇلار قۇرۇلما جەھەتتىن جانلىق بولۇپ ، ئۇلارنىڭ nsp9 (26 28 ، 38) بەلگىسى يوق شەكىلدە بايقىلىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ، بۇ ئۇلارنىڭ چەكلىك تەبىئىي ئۆزگىرىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ مۇھىم تەرتىپكە باغلىق (ئىككىنچى دەرىجىلىك قۇرۇلما بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئەمەس) nsp9 N تېرمىنال پارچىسىنىڭ ئىقتىدارى.بۇ رايوندىكى ساقلانغان قالدۇق ماددىلارنىڭ ئالا (5C ۋە D ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S8 رەسىم) نىڭ كۆرسىتىشىچە ، N3826 ۋىرۇستا nsp9 NMPylation ئۈچۈن ئىنتايىن مۇھىم ، N3825A ۋە E3827A نىڭ ئورنى NMPylation نىڭ تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، ئەمما M3829A ۋە P3830A نىڭ ئورنى يوق. .ئېنىقكى nsp9 NMPylation غا تەسىر كۆرسىتىدۇ.گەرچە N تېرمىنالى Asn (N3825A, N3825S) نىڭ ئورنىنى ئېلىش پەقەت nsp9 NMPylation ۋە ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىكى ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىگە پەقەت ئوتتۇراھال تەسىر كۆرسەتكەن بولسىمۇ (5C ۋە D رەسىم) ، N تېرمىنالى 3825-NN دىپپېتىدتىن ئاسن قالدۇق تەرتىپىنى ئۆچۈرۈۋەتتى. ۋىرۇسقا نىسبەتەن ئەجەللىك ئىكەنلىكى ئىسپاتلاندى ، بۇ N- تېرمىنالدىكى باشقا قالدۇقلارنىڭ ئالدىدا بىر ئاسن قالدۇقىنىڭ تەلەپ قىلىنىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، ئەڭ ياخشىسى ئاسن ، گەرچە بۇ خىل قالدۇق ماددىلارنى ئالماشتۇرۇشقا قىسمەن يول قويغىلى بولىدىغاندەك قىلسىمۇ (5B ، C ۋە D رەسىم).بىز خۇلاسە چىقىرىمىزكى ، 3825-NN دىپتېپتىد ، بولۇپمۇ تاجىسىمان ۋىرۇس دائىرىسىدىكى ساقلانغان ۋە كەم بولسا بولمايدىغان N3826 قالدۇقى (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S6 رەسىم) ، NiRAN نىڭ ئاكتىپ تور بېكىتىدىكى nsp9 N- تېرمىنۇسنىڭ توغرا باغلىنىشى ۋە يۆنىلىشىگە كاپالەتلىك قىلىدۇ.

ئالا (E3827A) نى بارلىق كىچىك ئائىلىلەرنىڭ ساقلانغان Glu غا ئالماشتۇرۇش ۋىرۇستا nsp9 NMPylation نى ساقلايدۇ ، ئەمما ھۈجەيرە مەدەنىيىتىدىكى ۋىرۇسلارغا ئەجەللىك (5C ۋە D رەسىم) ، بۇ قالدۇقنىڭ قوشۇمچە ئىقتىدارىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، مەسىلەن ئاچقۇچلۇق ئۆز-ئارا تەسىردە (NMPylated ياكى ئۆزگەرتىلمىگەن) ) nsp9 N- تېرمىنۇس ۋە ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىگە مۇناسىۋەتلىك باشقا ئامىللار.Nsp9 نىڭ ئۆزگىرىشى nsp9 نىڭ ئاقسىل جەريانىغا ياكى ئۇنىڭغا قوشنا بولغان nsps (39) غا تەسىر كۆرسەتمىگەن (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S9 رەسىم) ، بۇ كۆزىتىلگەن بىر قانچە nsp9 ئۆزگىرىشنىڭ ئەجەللىك فېنوتىپلىرىنىڭ C ئاقسىللىق جەريان تېرمىنالى pp1a رايونىنىڭ قالايمىقانلىشىشىدىن ئەمەسلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. .

يۇقارقى سانلىق مەلۇماتلار pp1a / pp1ab دىكى nsp8 | 9 تازىلاش تور بېتىنى Mpro ئارقىلىق مۇرەسسە قىلغاندىن كېيىن ، nsp9 نىڭ N تېرمىنالىنىڭ UMPylated (ياكى باشقا NMP بىلەن قىسمەن ئۆزگەرتىلگەن) بولىدىغانلىقىنى ئىسپاتلاپ بېرىدۇ.بۇنىڭدىن باشقا ، nsp9 نىڭ N- تېرمىنالىنىڭ ياخشى ساقلىنىشى (تاجىسىمان ۋىرۇس ئائىلىسىدىكى يەككە ۋە ئۆزگەرمەس ئاسن قالدۇقلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) ۋە بۇ تەتقىقاتتا ئېرىشكەن تەتۈر گېن سانلىق مەلۇماتلىرى (3E ۋە 5D رەسىملەر) تەسۋىرلەنگەن nsp9 NMPylation نى يەكۈنلەشكە يېتەكلىدى. تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىدە بىئولوگىيىلىك مۇناسىۋەتلىك ۋە ئىنتايىن مۇھىم.بۇ ئۆزگەرتىشنىڭ فۇنكسىيەلىك ئاقىۋەتلىرى داۋاملىق تەتقىق قىلىنىۋاتىدۇ ، مەسىلەن ، ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن (كونكرېت بولمىغان) nsp9 (ئۆزگەرتىلمىگەن شەكىل) RNA باغلاش پائالىيىتى (2628).N تېرمىنال NMPylation يەنە nsp9 نىڭ ئاقسىل ياكى RNA سۇيۇقلۇقى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى ياكى ئوخشىمىغان تۆت دەرىجىلىك قۇراشتۇرۇشنىڭ شەكىللىنىشىگە تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن.بۇلار قۇرۇلما تەتقىقاتىدا كۆزىتىلگەن ۋە تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشى بىلەن ئىقتىدار جەھەتتىن مۇناسىۋەتلىك ئىكەنلىكى ئىسپاتلانغان ، گەرچە بۇ ئۆزگەرتىش بولمىغان ئەھۋال ئاستىدا (26- 29- ، 40-).

گەرچە تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN تور نامىنىڭ نىشان ئالاھىدىلىكى يەنىلا تېخىمۇ تەپسىلىي گەۋدىلىنىشى كېرەك بولسىمۇ ، ئەمما سانلىق مەلۇماتلىرىمىز شۇنى ئىسپاتلىدىكى ، تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN تور نامىنىڭ ئاقسىل نىشان ئالاھىدىلىكى ئىنتايىن تار.گەرچە بارلىق نىدوۋىرۇس ئائىلىلىرىنىڭ NiRAN ساھەسىدىكى مۇھىم ئاكتىپ ئورۇن قالدۇقلىرىنى قوغداش (8،16) ساقلانغان NMPylator بۇ ئاقسىللارنىڭ پائالىيىتىنى كۈچلۈك قوللىغان بولسىمۇ ، ئەمما بۇ تورنى قوغداش ۋە قوغداشنىڭ ئاستىرتتىن باغلىنىدىغان يانچۇق قالدۇقلىرىنىڭ كىملىكى يەنىلا ئالاھىدىلىككە ئىگە. ھەمدە نىدوۋىرېلېس مەقسىتىدىكى ئوخشىمىغان ئائىلىلەر ئارىسىدا پەرقلىنىشى مۇمكىن.ئوخشاشلا ، باشقا ئۇلانغان ۋىرۇسلارنىڭ مۇناسىۋەتلىك نىشانلىرى تېخى ئېنىقلانمىدى.ئۇلار بەلكىم nsp9 ياكى باشقا ئاقسىللارنىڭ يىراقتىكى ورتولوگلىرى بولۇشى مۇمكىن ، چۈنكى ئادەتتە ئۇۋا ۋىرۇسىدا ساقلىنىدىغان بەش كۆپەيتىلگەن دائىرە سىرتىدىكى تەرتىپلەر ئانچە ياخشى ساقلانمايدۇ (8) ، بۇنىڭ ئىچىدە Mpro بىلەن NiRAN ئارىسىدىكى گېن گۇرۇپپىسىمۇ بار ، بۇنىڭ ئىچىدە nsp9 بولسا coronavirus.

بۇنىڭدىن باشقا ، بىز ھازىر NiRAN تور نامىنىڭ قوشۇمچە (ھۈجەيرە ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ) نىشان بولۇش ئېھتىماللىقىنى نەزەردىن ساقىت قىلالمايمىز.بۇ خىل ئەھۋالدا تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى ، بۇ يېڭىدىن بارلىققا كەلگەن ئاقسىل NMPylators (NMPylators) (30 ، 31) دىكى باكتېرىيە گومولوگىيىسىدە «ئۇستاز تەڭشىگۈچ» باردەك قىلىدۇ؟NMP ھەر خىل ھۈجەيرە ئاقسىلىنى تەڭشەپ ، ئۇلارنىڭ تۆۋەنكى ئېقىندىكى پائالىيىتىنى تەڭشەيدۇ ياكى يوقىتىدۇ ، بۇ ئارقىلىق ھۈجەيرە بېسىمىغا تاقابىل تۇرۇش ۋە قىزىل قان تومۇر ئۆسمىسى قاتارلىق ھەر خىل بىئولوگىيىلىك جەريانلاردا رول ئوينايدۇ (22 ، 33).

بۇ تەتقىقاتتا (2-ۋە 4-رەسىملەر ۋە SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، S3 ۋە S5 رەسىملەر) ، بىز nsp12 نىڭ UMP (NMP) قىسمىنى nsp9 دىكى يەككە (ساقلانغان) ئورۇنغا يۆتكىگەنلىكىنى ، باشقا ئاقسىللارنىڭ ئۆزگەرتىلمىگەنلىكىنى ئىسپاتلىيالىدۇق. ئىشلىتىلگەن شارائىتتا ، ئېنىق بېكىتىلگەن (بوش ئەمەس) تارماق بالا خاسلىقىنى قوللايدۇ.بۇنىڭغا ماس ھالدا ، N تېرمىنالى nsp9 NMPylation غا سېلىشتۇرغاندا ، nsp12′s نىڭ ئۆزىنىڭ NMPylation پائالىيىتى ئىنتايىن تۆۋەن ، ئۇنى بايقاش ئاپتوماتىك رادىئاتسىيەنىڭ ئاشكارلىنىش ۋاقتىنى تەلەپ قىلىدۇ ، nsp12 قويۇقلۇقى 10 ھەسسە ئاشۇرۇلىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، بىزنىڭ MS تەھلىلىمىز NMP12 نىڭ NMPylation نى ئىسپات بىلەن تەمىنلىيەلمىدى ، بۇ NiRAN تور نامىنىڭ ئۆزلۈكىدىن NMPylation نىڭ (ئەڭ ياخشىسى) ئىككىنچى دەرىجىلىك پائالىيەت ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.قانداقلا بولمىسۇن ، شۇنىڭغا دىققەت قىلىش كېرەككى ، باشقا تەتقىقاتلار باكتېرىيە NMPylator نىڭ ئۆزلۈكىدىن AMPylation ھالىتىنىڭ باشقا ئاقسىلنىڭ ئاستى قىسمىدىكى NMPylation پائالىيىتىنى كونترول قىلالايدىغانلىقىنى دەسلەپكى ئىسپات بىلەن تەمىنلىدى (22 ، 33).شۇڭلاشقا ، EAV nsp9 (16) ۋە تاجىسىمان ۋىرۇس nsp12 (بۇ تەتقىقات) ئۈچۈن دوكلات قىلىنغان ئۆزلۈكىدىن NMPylation پائالىيىتىنىڭ مۇمكىن بولغان ئىقتىدار ئۈنۈمىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن تېخىمۇ كۆپ تەتقىقاتقا موھتاج ، بۇ C تېرمىنال RdRp تور نامىنىڭ قاتلىنىشىغا تەكلىپ قىلىنغان چاپېرونغا ئوخشاش ئۈنۈمنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. 16)).

ئىلگىرى ، نىدوۋىر ۋىرۇسى NiRAN تور نامىنىڭ تۆۋەنكى ئېقىندىكى ئىقتىدارلىرىغا مۇناسىۋەتلىك بىر قانچە پەرەز كۆزدە تۇتۇلدى ، بۇلار RNA ligase ، RNA قاپلانغان گانىلات يۆتكەش ۋە ئاقسىلنى ئاساس قىلىش پائالىيىتى (16) نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ ، ئەمما ئۇلارنىڭ ھېچقايسىسى بار بولغان تۆۋەن ئېقىندىكى ئىقتىدارلارغا ماس كەلمەيدۇ.تۆۋەندىكى ئورۇنلاردا ئېرىشكەن ئۇچۇرلار قوشۇمچە پەرەز قىلمايلا ئوخشاش.بۇ تەتقىقاتتا ئېرىشكەن سانلىق مەلۇماتلار NiRAN دائىرىسىنىڭ ئاقسىل كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان RNA بىرىكتۈرۈشنى قوزغىتىشقا قاتناشقانلىقى بىلەن ئەڭ ماس كېلىدۇ (ئەمما ئىسپاتلىيالمايدۇ).ئىلگىرى NiRAN تور نامىنىڭ ئىقتىدارى 5 دەپ قارالغان؟²-RNA قاپلاش ياكى RNA ئۇلىنىش ئىنكاسى بۇلارنىڭ ۋە باشقا سانلىق مەلۇماتلارنىڭ قوللىشىغا تەسىر كۆرسەتمەيدۇ.شۇڭلاشقا ، مەسىلەن ، NiRAN نىڭ ئاكتىپ تور بېكىتى ساقلانغان Asp نى ئومۇمىي بازا دەپ قارايدۇ (Pseudomonas syringae SelO دىكى D252; HCoV-229E pp1ab دىكى D4271 ؛ SARS-CoV-2 nsp12 دىكى D208) (SI قوشۇمچە ، 2-رەسىم) ).S2). 41).بۇنىڭدىن باشقا ، تاجىسىمان ۋىرۇس NiRAN نىڭ ساقلانغان ئاقسىل نىشانىدىكى كۆرۈنەرلىك تەرتىپلىك ئالاھىدىلىكى ۋە NTP ھەمكارلاشقۇچىلىرى (UTP نى ياخشى كۆرىدۇ) نىڭ ئازادە ئالاھىدىلىكى NiRAN ۋاسىتىلىك قاپلاش ئېنزىم ياكى RNA ligase غا ئوخشاش ئىقتىدارلارغا قارشى تۇرىدۇ.

ئېنىقكى ، دەلىللەش ئۈچۈن نۇرغۇن قوشۇمچە خىزمەتلەر لازىم ، ئەگەر ئىسپاتلانسا ، nsp9-UMP (nsp9-NMP) نىڭ ئاقسىل كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان RNA بىرىكتۈرۈشتىكى رولى ھەققىدە تەپسىلىي چۈشەنچە بېرىش كېرەك ، بۇلار ئىلگىرى خەۋەر قىلىنغان بىر قانچە قىزىقارلىق ، ئەمما (ھازىرغىچە) دوكلاتلارنى تۇتاشتۇرىدۇ. .يالغۇز كۆزىتىش.مەسىلەن ، تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ مەنپىي بەلۋاغ RNA نىڭ ئاخىرلىشىشىنىڭ ئولىگو (U) تالدىن باشلىنىدىغانلىقى ئېنىقلاندى (42 ، 43).بۇ كۆزىتىش مەنپىي بەلۋاغ RNA نىڭ بىرىكىشى nMP9 نىڭ UMPylated شەكلىنى كۆپ قۇتۇپ (A) قۇيرۇقى (قوزغاتقۇچ) بىلەن باغلاش ئارقىلىق قوزغىتىلغانلىقى توغرىسىدىكى قاراش بىلەن بىردەك بولۇپ ، ئۇنىڭ RNA باغلىنىشى ئارقىلىق پائالىيەت ۋە ياكى ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىشى مۇمكىن. يەنە بىر RTC ئاقسىلى.Nsp9 تەمىنلىگەن UMP قىسمىنى كېيىن nsp7 / 8 / nsp12 ۋاسىتىلىك oligouridylation ئۈچۈن «دەسلەپكى» قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، گېنتىكى RNA دىكى 3 ?? picornavirus VPg ئاقسىلى (44) ئۈچۈن ئورنىتىلغان مېخانىزىمغا ئوخشاش قېلىپ رولىنى ئوينايدۇ.ئەگەر بۇ تەكلىپ «ئۆلچەمسىز» بولسا قانداق بولار؟؟؟؟(ئاقسىل كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان) مەنپىي بەلۋاغ RNA بىرىكتۈرۈشنىڭ باشلىنىشى كۆزىتىشكە ئۇلىنىش بىلەن تەمىنلەيدۇ ، بۇ تاجىسىمان ۋىرۇس مەنپىي بەلۋاغ RNA نىڭ ئاخىرىدا UMP (UTP نىڭ ئورنىدا) بارلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ كۆرسەتكۈچنى كۆرسىتىدۇ. يادرو كىسلاتاسى Dicer نامەلۇم سۈيدۈككە خاس ئىچكى ئاجراتما ئارقىلىق فوسفورلانغان ئاخىرقى فوسفورنى تازىلايدۇ.ئەگەر جەزملەشتۈرۈلسە ، بۇ يادرو كىسلاتاسىنىڭ گىدرولىتتىك پائالىيىتى يېڭىدىن پەيدا بولغان مەنپىي بەلۋاغنىڭ 5 ² ئۇچىدىن nsp9 نىڭ ئولىگومېرلىق UMPylated شەكلىنى قويۇپ بېرىدۇ.Nsp9 نىڭ ئاقسىل ئىپتىدائىي بولۇشىدىكى رولى ئىلگىرىكى تەتۈر گېن تەتقىقاتى بىلەنمۇ بىردەك بولۇپ ، تەتقىقات نەتىجىسىدە كۆرسىتىلىشچە ، nsp9 (ۋە nsp8) تاجىسىمان ۋىرۇس گېننىڭ 3 ئۇچىغا يېقىن جايدا ساقلانغان cis رولىنى ئوينايدىغان RNA ئېلېمېنتى بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدۇ.45).بۇ دوكلاتقا ئاساسلانغاندا ، بۇ ئىلگىرىكى كۆزىتىشلەرنى ئەمدى قايتا تەكشۈرۈش ۋە يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەتقىق قىلىش ئارقىلىق كېڭەيتكىلى بولىدۇ.

خۇلاسىلەپ ئېيتقاندا ، سانلىق مەلۇماتلىرىمىز N تېرمىنالىدا RdRp غا ئۇلانغان ئىگىدارچىلىق ئۇۋىسى ۋىرۇس ئېنزىم بەلگىسىنىڭ كونكرېت پائالىيىتىنى بەلگىلىدى.تاجىسىمان ۋىرۇستا ، يېڭىدىن بايقالغان NiRAN ۋاسىتىلىك UMPylator / NMPylator پائالىيىتى Mn2 + ۋە ئۇنىڭغا قوشنا بولغان Asn قالدۇقلىرىغا تايىنىپ ، N تېرمىنالىدىكى دەسلەپكى ئامىنە بىلەن (تۆۋەن ئېنېرگىيىلىك) فوسفورلۇق زايومنىڭ شەكىللىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.Nsp8 | 9 تازىلاش تور بېكىتىدىكى Mpro ئارقىلىق مۇرەسسە قىلىش ئارقىلىق ، nsp9 نىشانىنى NMPylation غا ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، بۇ ئاقسىل بىلەن NiRAN تور نامىنىڭ ئىقتىدار باغلىنىشىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ RdRp غا تۇتىشىدۇ.Nsp12 NiRAN ئاكتىپ تور بېكىتى ۋە nsp9 نىشانىدىكى مۇھىم قالدۇق ماددىلارنى قوغداش SARS-CoV-2 نى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئىككى تاجىسىمان ۋىرۇستىن ئېرىشكەن سانلىق مەلۇماتلار بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، nsp9 NMPylation نىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسنىڭ كونسېرۋاتىپلىق ئىقتىدارىنىڭمۇ ۋىرۇسنىڭ كۆپىيىشىدىكى مۇھىم قەدەم ئىكەنلىكىنى كۈچلۈك ئىسپات بىلەن تەمىنلەيدۇ.بار بولغان سانلىق مەلۇماتلار NMPylated شەكلىدىكى Nsp9 نىڭ ئاقسىل كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان RNA بىرىكتۈرۈلۈشىدىكى كونكېرت رولى تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە باشقا ئۇۋا ۋىرۇسى ئۈچۈن مۇۋاپىق ئەھۋال ، NiRAN باشقا نامەلۇم ئاقسىللارنىمۇ نىشان قىلىشى مۇمكىن دەپ يەكۈن چىقىرىمىز.ۋىرۇسنى تەڭشەش.ساھىبجامال ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش.ئەگەر ئىسپاتلانسا ، ئاقسىل پرېرمېرلىرىنىڭ ۋىرۇسلۇق RNA بىرىكتۈرۈلۈشىگە ئارىلىشىشى Mpro / 3CLpro ۋە RdRp ساھەلىرىنىڭ ئىلگىرى بايقالغان تاجىسىمان ۋىرۇس ۋە پىكورناۋىرۇسقا ئوخشاش دەرىجىدىن تاشقىرى گۇرۇپپا (9) ئارىسىدىكى تەرتىپلىك يېقىنلىقىنى ئاشۇرىدۇ ، بۇلار يېقىندا قۇرۇلغان پىسونىۋىرىتتا بىرلىككە كەلدى (9). 46) كاتېگورىيەدە.

سانلىق مەلۇماتلىرىمىز يەنە بۇ تەتقىقاتتا ئېنىقلانغان ئاساسىي ، تاللاش ۋە مۇتەئەسسىپ فېرمېنت پائالىيىتىنى ۋىرۇسقا قارشى دورىلارنىڭ نىشانى سۈپىتىدە ئىشلىتىشكە بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى.NiRAN نىڭ ئاكتىپ تور بېكىتىدە ساقلانغان nsp9 N- تېرمىنالىنىڭ باغلىنىشى (ۋە كېيىنكى ئۆزگەرتىلىشى) گە تەسىر يەتكۈزىدىغان بىرىكمىلەرنى ئۈنۈملۈك ۋە كۆپ خىل ۋىرۇسقا قارشى دورىلار قىلىپ تەرەققىي قىلدۇرغىلى بولىدۇ ، بۇ ھايۋانلار ۋە ئىنسانلارنىڭ تاجىسىمان ۋىرۇسىنى ئوخشىمىغان (تارماق) تۈردىكى يۇقۇملىنىشتىن داۋالاشقا ماس كېلىدۇ. SARS-CoV-2 ۋە ئوتتۇرا شەرق نەپەس يولى ئۇنىۋېرسال كېسەللىكى كورونا ۋىرۇسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.

بۇ تەتقىقاتتا ئىشلەپچىقىرىلغان تاجسىمان ۋىرۇسنىڭ كودلاش تەرتىپى RT-PCR تەرىپىدىن HCoV-229E ياكى SARS-CoV-2 بىلەن يۇقۇملانغان Huh-7 دىن ئايرىپ ئېلىنغان RNA ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن ھەمدە ئۆلچەملىك كلونلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق قىستۇرۇلغان.pMAL-c2 (يېڭى ئېنگلاند بىئولوگىيىلىك تەجرىبىخانىسى) ياكى pASK3-Ub-CHis6 (47) ئىپادىلەش ۋېكتورى (SI قوشۇمچە ، جەدۋەل S1 ۋە S2).يەككە كود ئالماشتۇرۇش PCR ئاساسىدىكى تور بېكەت يېتەكچىلىكىدىكى mutagenesis تەرىپىدىن ئوتتۇرىغا قويۇلدى (48).MBP بىرىكتۈرۈش ئاقسىلى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ، E. coli TB1 ھۈجەيرىسى مۇناسىپ pMAL-c2 پىلازما قۇرۇلمىسى بىلەن ئۆزگەرتىلدى (SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل).بىرىكتۈرۈلگەن ئاقسىل ئامىلوزا يېقىنلىقى خروموگرافىيىسى ئارقىلىق ساپلاشتۇرۇلۇپ ، Xa ئامىلى بىلەن چاپلانغان.ئۇنىڭدىن كېيىن ، C تېرمىنالى His6 بەلگىلىك ئاقسىل ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك Ni-immobilized مېتال يېقىنلىق خروموگرافىيىسى (Ni-IMAC) تەرىپىدىن ساپلاشتۇرۇلدى.ھەممە يەرنى قاپلاش ئاقسىلى ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ، E. coli TB1 ھۈجەيرىسى ماس كېلىدىغان pASK3-Ub-CHis6 پىلازما قۇرۇلمىسى (SI قوشۇمچە نۇسخىسى ، جەدۋەل S1 ۋە S2) ۋە pCGI پىلازما DNA نى ئىشلىتىپ ، ھەممە يەرنى قاپلىغان C تېرمىنال گىدروزا 1 (Ubp1) نى ئىشلەتكەن.ئۆزگەرتىش (47).C تېرمىنالى His6 بەلگىلىك تاجسىمان تاجىسىمان ئاقسىل ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ساپلاشتۇرۇلغان (50).

HCoV-229E nsp12-His6 نىڭ ئۆزلۈكىدىن NMPylation سىنىقى EAV nsp9 (16) دە تەسۋىرلەنگەندەك ئېلىپ بېرىلدى.قىسقىسى ، nsp12-His6 (0.5 µM) تەركىبىدە 50 mM 4- (2-گىدروكىئىسېتىل) -1-تۇرۇبازىنېتانىس سۇلفونىك كىسلاتا (HEPES) -KOH ، pH 8.0 ، 5 mM دىتىئوترېيتول (DTT) ، 6 mM MnCl2 ، 25 µM بۇففېر ، يوشۇرۇن كۆرسىتىلگەن NTP بىلەن 0.17 µM ماسلاشتۇرۇلغان [α32-P] NTP (3000 Ci / mmol; Hartmann Analytic) 30 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت.Nsp12 ۋاسىتىلىك nsp9 NMPylation نىڭ باشقا بارلىق (ئۆلچەملىك) NMPylation تەسۋىرىدە ، ئىنكاس شارائىتى تۆۋەندىكىدەك تەڭشەلدى: nsp12-His6 (0.05 µM) ۋە nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM NTP نى كۆرسەتتى ، 0.17 µM ماسلاشتۇرۇلغان [α32-P] NTP.30 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت يوشۇرۇنغاندىن كېيىن ، رېئاكسىيە ئەۋرىشكىسىگە SDS-PAGE ئەۋرىشكە بۇففېر ئارىلاشتۇرۇلدى: 62.5 mM ترىس (گىدروكىسمېتىل) ئامىنومېتان HCl (pH 6.8) ، 100 mM DTT ،% 2.5 SDS ،% 10 گلىتسېرىن ۋە% 0.005 لىك بروموفېنول. كۆك.ئاقسىل 90 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت قىزىتىش ئارقىلىق ئايرىلدى ۋە% 12 SDS-PAGE بىلەن ئايرىلدى.گېلى مۇقىم ۋە بويالغان Coomassie Brilliant كۆك ئېرىتمىسى (% 40 مېتانول ،% 10 لىك كىسلاتا كىسلاتاسى ،% 0.05 لىك Coomassie Brilliant كۆك R-250) بىلەن بېزەلگەن ، 20 سائەت فوسفورلۇق تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئېكرانى بىلەن ئۇچراشقان (NMPylation دىن nsp12 نى بايقاش) ياكى (ئەڭ چوڭ) 2 سائەت (nsp9 NMPylation نى باھالاش).ئېكراننى سىكانىرلاش ئۈچۈن تەيفېڭ بورىنى 9200 تەسۋىر (GE Healthcare) ئىشلىتىلگەن ، ImageJ سىگنالنىڭ كۈچلۈكلۈك دەرىجىسىنى تەھلىل قىلىشقا ئىشلىتىلگەن.

MS تەھلىلى ئۈچۈن ، 1 µM nsp12-His6 ۋە 10 µM nsp9 (hexahistidine بەلگىسى يوق) NMPylation ئانالىزىدا (SI قوشۇمچە جەدۋىلى ، S1 جەدۋەل) ۋە 500 µM UTP ۋە GTP نىڭ قويۇقلۇقى ئېشىپ كەتتى.ئۇلارنىڭ قويۇقلۇقى ۋە مۆلچەردىكى ئاقسىلنىڭ سۈپىتىگە ئاساسەن ، MassPrep تۈۋرۈكى (سۇ) قاچىلانغان سۇ ACQUITY H دەرىجىلىك HPLC سىستېمىسى توردا 1 ~ 10 µL لىك بۇففېرلىق ئاقسىل ئېرىتمىسىنى تۇزسىزلاندۇردى.تۇزسىزلاشتۇرۇلغان ئاقسىل Synapt G2Si ماسسىسى سپېكترومېتىر (سۇ) نىڭ ئېلېكتروسپاي ئىئون مەنبەسىگە تۆۋەنلىتىلىدۇ ، بۇففېر A (سۇ /% 0.05 لىك فورمات كىسلاتا) ۋە بۇففېر B (ئاتسېتىنىترىل /% 0.045 لىك كىسلاتا) دىن ئىبارەت. 60 سېلسىيە گرادۇس ۋە ئېقىش سۈرئىتى مىنۇتىغا 0.1 mL: ئېلىۋېتىش دېموكراتىك ئۇسۇلدا% 5 A بىلەن 2 مىنۇت ، ئاندىن سىزىقلىق گرادېنت 8 مىنۇت ئىچىدە% 95 B غا يېتىدۇ ،% 95 B نى يەنە 4 مىنۇت ساقلايدۇ.

ماسسىسى 500 دىن 5000 m / z بولغان مۇسبەت ئىئونلار بايقالدى.Glu-fibrinopeptide B ھەر 45 سېكۇنتتا ئاپتوماتىك ئاممىۋى يۆتكىلىشنى تۈزىتىش ئۈچۈن ئۆلچىنىدۇ.MaxEnt1 كېڭەيتىلمىسى بىلەن MassLynx ئەسۋاب يۇمشاق دېتالىنى ئىشلىتىپ ، ئاساسىي سىزىقنى چىقىرىۋەتكەندىن كېيىن ئوتتۇرىچە سپېكترىنى يېشىپ بېرىڭ.

UMPylated HCoV-229E nsp9 رەت تەرتىپى ئۆزگەرتىلگەن تىرىپسىن (سېرۋا) نى قوشۇش ئارقىلىق ھەزىم قىلىنغان ۋە بىر كېچە 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھالەتتە يوشۇرۇنغان.پېپتىدلارنى تۇزسىزلاشتۇرۇش ۋە مەركەزلەشتۈرۈش ئۈچۈن Chromabond C18WP ئايلانما تۈۋرۈكى (بۆلەك نومۇرى 730522 ؛ Macherey-Nagel) ئىشلىتىلگەن.ئاخىرىدا ، پېپتىد 25 µL سۇدا ئېرىپ ، تەركىبىدە% 5 ئاتسېتىنىترىل ۋە% 0.1 لىك كىسلاتا بار.

بۇ ئەۋرىشكەلەر MS تەرىپىدىن Orbitrap Velos Pro ئاممىۋى سپېكترى ئۆلچەش ئەسۋابى (Thermo Scientific) ئارقىلىق تەھلىل قىلىنغان.ئەڭ ئاخىرقى nanoâ HPLC سىستېمىسى (Dionex) ، ئۆزىگە خاس بولغان 50 سانتىمېتىر ئورنىتىلغان.75 μm C18 RP تۈۋرۈكىگە 2.4 μm ماگنىتلىق مونچاق قاچىلانغان (Dr. Albin Maisch يۇقىرى ئىقتىدارلىق LC GmbH) Proxeon nanospray مەنبەسى ئارقىلىق توردىكى ئاممىۋى سپېكترىغا ئۇلىنىدۇ.300 µm ئىچكى دىئامېتىرىغا 6 µL تىرىپسىن ھەزىم قىلىش ئېرىتمىسىنى ئوكۇل قىلىڭ ??1 سانتىمېتىر C18 PepMap ئالدىن قويۇلۇش ئىستونى (تېرمو ئىلمىي).سۇ /% 0.05 لىك كىسلاتانى ئېرىتكۈچى قىلىپ ئىشلىتىپ ، ئەۋرىشكە مىنۇتىغا 6 µL / min لىك سۈرئەت بىلەن ئاپتوماتىك قاپسىلىپ تۇزسىزلاندۇرۇلدى.

تۆۋەندىكى گىرادۇسلۇق سۇ /% 0.05 لىك كىسلاتا (ئېرىتكۈچى A) ۋە% 80 لىك ئاتسېتىنىترىل /% 0.045 لىك فورمات كىسلاتاسى (ئېرىتكۈچى B) تىرىپتىك پېپتىدلارنىڭ ئېقىش سۈرئىتى 300 nL / min: 4% B. 5 مىنۇت ، ئاندىن 30 مىنۇتلۇق سىزىقلىق گرادېنت بىر نەچچە مىنۇت ئىچىدە% 45 B ، سىزىق 5 مىنۇت ئىچىدە% 95 ئېرىتكۈچى B غا ئۆسىدۇ.خروموگرافىك تۈۋرۈكنى داتلاشماس پولات نانو قويۇپ بەرگۈچى (Proxeon) غا ئۇلاڭ ، ھەمدە 2300 V لىك يوشۇرۇن كۈچنى ئىشلىتىپ ، ئېلېكتر سپېكترىسىنىڭ قىزىتىلغان قىل قان تومۇرغا بىۋاسىتە پۈركۈڭ. كەم دېگەندە ئۈچ سانلىق مەلۇمات MS / MS سىكانىرلاش ئارقىلىق ھەرىكەتچان ھالدا 30 سېكۇنت ئىچىدە چىقىرىۋېتىلىدۇ ، سىزىقلىق ئىئون توزاق سوقۇلۇشتىن كېلىپ چىققان پارچىلىنىش ياكى تېخىمۇ يۇقىرى ئېنېرگىيە سوقۇلۇش پارچىلىنىش ئوربىتىسىنى تەكشۈرۈش بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، ئېنىقلىق دەرىجىسى 7500.


يوللانغان ۋاقتى: 8-ئاۋغۇستتىن 20-ئاۋغۇستقىچە